貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)為淀粉液化芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌親緣相近的新種,三者均是生產(chǎn)surfactin的主要菌種。surfactin是構(gòu)成抗菌脂肽的核心成分,具有極強(qiáng)的生物表面活性,表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌作用及良好的起泡性和乳化性能,在食品、醫(yī)藥、化妝品和養(yǎng)殖等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。然而目前大多數(shù)芽孢桿菌的surfactin產(chǎn)率較低,其中的原因也尚不知曉,是制約surfactin大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的主要原因。此外,目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)surfactin的工藝中,常通過轉(zhuǎn)速提升增加溶氧量以實(shí)現(xiàn)surfactin的過量積累。但是具有生物表面活性劑特性的surfactin在轉(zhuǎn)速過高的環(huán)境中會(huì)形成過量泡沫而出現(xiàn)“跑液”現(xiàn)象,進(jìn)而造成surfactin的大量損耗。所以溶氧環(huán)境是決定surfactin產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。因此,本論文以高產(chǎn)surfactin的貝萊斯芽孢桿菌CMT-6為研究菌株,利用全基因組從頭測(cè)序技術(shù)分析CMT-6的基因組信息,挖掘合成surfactin的關(guān)聯(lián)基因,同時(shí)與另外三株產(chǎn)量較低的芽孢桿菌進(jìn)行比較基因組學(xué)研究,揭示surfactin合成能力差異的原因,解析高產(chǎn)菌株的surfactin合成基因的特征,進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究不同溶氧條件下CMT-6的轉(zhuǎn)錄組信息,探明溶氧調(diào)控surfactin合成的關(guān)鍵基因和代謝通路,為天然高產(chǎn)菌株的高效篩選和工程菌株的構(gòu)建,以及為低氧高產(chǎn)surfactin生產(chǎn)工藝的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)和提供新的思路。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1、對(duì)CMT-6進(jìn)行全基因組從頭測(cè)序,分析CMT-6基因組組分及功能,特異性篩查抗菌脂肽相關(guān)基因,并采用TOF-MS技術(shù)檢測(cè)CMT-6發(fā)酵液中脂肽成分。結(jié)果表明,CMT-6基因組為3,928,489 bp,GC含量為46.55%。COG注釋得到的基因主要涉及碳水化合物、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝等。KEGG注釋得到的基因主要參與碳水化合物代謝和信號(hào)傳導(dǎo)路徑中。注釋到GO中的基因主要行使催化活性、代謝過程和細(xì)胞分化過程。以上這些基因能使菌體高效響應(yīng)外界環(huán)境變化,為CMT-6的生長提供營養(yǎng)物質(zhì),編碼合成更多的脂肽前體物質(zhì)。CMT-6含有完整的surfactin合成酶基因,srfAA-AD;合成surfactin的相關(guān)基因比iturin和fengycin的多。CMT-6發(fā)酵產(chǎn)物含有的surfactin組分(m/z:994.6,1008.6,1009.6,1010.6,1022.6,1036.6)比iturin(m/z:1044.6,1058.6,1059.6)和fengycin(m/z:1434.6)的豐富。脂肽合成基因的數(shù)量與脂肽組分的豐富度呈正相關(guān),是CMT-6過量積累surfactin的重要原因。2、選取不同種屬的芽孢桿菌B.subtilis 168、B.amyloliquefaciens DSM7~T和B.velezensis FZB 42,與CMT-6的基因組進(jìn)行比較分析,從基因組水平揭示不同種屬芽孢桿菌產(chǎn)surfactin能力差異的來源。結(jié)果顯示,CMT-6與FZB 42有非常保守的序列結(jié)構(gòu),親緣關(guān)系最近,其次為DSM7~T,與168菌株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。不同菌株間的共線性關(guān)系與親緣關(guān)系吻合,遺傳背景會(huì)引起菌株合成surfactin能力的差異。CMT-6與FZB 42和DSM7~T均共有5個(gè)surfactin合成基因;與168菌株僅有3個(gè)共有基因,相似度較低。菌株間共有基因的數(shù)量及其相似度影響surfactin的合成。CMT-6與FZB42僅有合成酶基因srfAC發(fā)生非同義突變,與DSM7~T的合成酶基因srfAA、srfAB、srfAC及相關(guān)基因spoVT、codY存在非同義突變,與168菌株除上述基因的非同義突變外,其srfAA還檢測(cè)到提前終止密碼子。合成酶基因發(fā)生的非同義突變會(huì)改變對(duì)氨基酸的特異性選擇,造成surfactin組分的差異。而合成酶中提前終止密碼子的出現(xiàn),會(huì)直接導(dǎo)致菌體喪失合成surfactin的能力。3、設(shè)置轉(zhuǎn)速分別為50 rpm(低溶氧)、100 rpm(中溶氧)、200 rpm(高溶氧)的溶氧組,收集菌體提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,研究不同溶氧處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異,挖掘溶氧調(diào)控surfactin的合成的關(guān)鍵基因和通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄組差異最大的是低溶氧組和中溶氧組,其差異基因功能主要富集到細(xì)菌型依賴鞭毛的運(yùn)動(dòng)和鞭毛基底兩個(gè)GO Item中和metabolic pathways的代謝通路上。中溶氧和高溶氧組的差異基因富集到7個(gè)GO Item中(集中在氧化還原過程),KEGG富集到不同環(huán)境中微生物代謝、碳代謝和雙組份系統(tǒng)三個(gè)通路上。從轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)高溶氧組中碳代謝、脂肪酸合成、雙組份系統(tǒng)、蛋白釋放等路徑中基因的表達(dá)可以編碼合成更多的surfactin前體物質(zhì),增強(qiáng)自身細(xì)胞對(duì)surfactin的耐受性,促進(jìn)surfactin的外排,有利于surfactin產(chǎn)量的提高。surfactin合成酶基因srfAA、srfAC、srfAD與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān),共同受sRNA rne5的調(diào)控;與產(chǎn)量呈正相關(guān)的基因有srfAB、spoVT、AbrB、comP和rapC。
【學(xué)位單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

究進(jìn)展以產(chǎn)生一類結(jié)構(gòu)相似，具有廣譜抗菌等活性的表面活性和多種生物活性，在多種脂肽中脫。結(jié)構(gòu)和性質(zhì)者 Arima 等人在枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中分離晰了 surfactin 的一級(jí)結(jié)構(gòu)，闡明了結(jié)構(gòu)中氨基。Surfactin 家族的結(jié)構(gòu)相似，是由一條碳原子數(shù)手性（LLDLLDL）的 7 個(gè)氨基酸殘基的小肽通量為 1,000 Da 左右，一般不超過 1,500 Da[76]。的碳原子個(gè)數(shù)及其不同的支鏈形式賦予了 surfa系物的種類[77]。其中，引起種類差異的氨基酸為 Val 或 Ile，而 Val、Ile 或 Leu 可存在于第 7 位

圖 1-2 surfactin 的三維結(jié)構(gòu)[74]Fig. 1-2 Three-dimensional structure of surfactin 20 μM 甚至更低濃度時(shí)，便可將水的表面張力從 72的去污劑小了約量個(gè)數(shù)量級(jí)[81, 82]。作為強(qiáng)有力的生物使 surfactin 分子中肽環(huán)伸入細(xì)胞的水相中，而非極性層中，細(xì)胞膜便會(huì)形成孔洞致使細(xì)胞質(zhì)外泄，破壞細(xì)生物活性及其應(yīng)用結(jié)構(gòu)，賦予 surfactin 眾多優(yōu)異的生物活性。Surfactin是于鈣離子的結(jié)合會(huì)發(fā)揮更強(qiáng)的破壞作用，因而使其tin 主要作用對(duì)象為細(xì)菌，但是與 iturinA 協(xié)同作用時(shí)的好[85]；surfactin 插入磷脂雙分子層造成細(xì)胞膜穿孔有代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素成為新一代抗生素的潛力。目前，

芽孢桿菌 CMT-6 的 surfactin 合成基因表征及其響應(yīng)溶氧的調(diào)控通路研進(jìn)而在 ATP 作用下腺苷化成為氨酰-AMP（氨酰腺苷酸）；氨酰-AM下 游 硫 醇 化 結(jié) 構(gòu) 域 ， 與 該 結(jié) 構(gòu) 域 上 的 輔 基 4’- 磷 酸 泛 酰 巰 基-sphopantetheine，4’-pp）形成硫酯鍵，以氨酰載體復(fù)合體傳送至縮合結(jié)構(gòu)域催化第一個(gè)氨基酸脫離其載體，以肽鍵的形式結(jié)合第二個(gè)模塊肽鏈向下一個(gè)模塊移動(dòng)，肽鏈以此形式得到不斷的延伸；待肽鏈中的完以后，硫酯酶結(jié)構(gòu)域完成分子的環(huán)化并釋放。surfactin 合成酶亞基各行其職，完成氨基酸的活化、肽鏈的延伸，并最終環(huán)化釋放出 surf

【參考文獻(xiàn)】

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2 朱玲燕;劉強(qiáng);劉洋;李霜;;培養(yǎng)基組分對(duì)枯草芽胞桿菌產(chǎn)表面活性素的影響[J];生物加工過程;2015年05期

3 倪鑫鑫;龔海燕;馬頂虹;嚴(yán)劍芳;;芽孢桿菌生理生化特性分析[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2015年07期

4 劉浩強(qiáng);李鴻筠;向可海;冉春;胡軍華;姚廷山;向琴;楊華;陳洪明;;生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對(duì)錦橙貯藏病菌敏感性和保鮮效果[J];食品工業(yè)科技;2015年04期

5 出曉銘;林毅雄;張s

本文編號(hào)：2831408