藍莓(Vaccinium spp.)是一種經(jīng)濟價值較高的越橘類漿果,其果實鮮食甘甜、營養(yǎng)豐富,尤其是果實中富含的花青苷對人體健康有諸多益處。因此挖掘藍莓果實發(fā)育調(diào)控因子并利用分子遺傳手段針對性的進行品種改良或培育藍莓新品種不僅具有重要的經(jīng)濟意義,而且在人類健康方面具有重要的社會意義。miRNA是一類長度為18-24nt的內(nèi)源非編碼RNA,是調(diào)控基因表達的重要作用因子,在果實發(fā)育和成熟過程中扮演重要角色。然而目前關于藍莓miRNA方面的研究還少有報道。本研究利用小RNA測序和降解組測序技術對藍莓果實發(fā)育的兩個關鍵時期(白熟期和藍熟期)的miRNA及其靶標進行鑒定,并構建了miRNA介導藍莓果實發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡。進一步利用藍莓轉(zhuǎn)化體系成功的將藍莓VcMIR156基因轉(zhuǎn)入到藍莓中,為深入研究該MIR基因的功能奠定了基礎。具體研究結果如下:1.構建了藍莓果實白熟期和成熟期sRNA測序文庫和降解組測序文庫,在sRNA測序文庫中鑒定了100個miRNA。其中包括來自28個miRNA家族的84個已知miRNA和16個新的miRNA。我們挑選從測序結果中挑選16個miRNA用stem-loop qPCR方法進行驗證,stem-loop qPCR結果與sRNA測序結果基因表達趨勢基本一致;降解組測序共鑒定了41個已知miRNA和7個新miRNA的178個靶標。用RLM-RACE對藍莓miR160的兩個靶標進行檢測,從而驗證了降解組測序的準確性。2.為了探究藍莓中已知miRNA的保守性,我們從NCBI下載葡萄成熟miRNA和pre-miRNA的序列并與藍莓sRNA測序得到的數(shù)據(jù)一起構建了進化樹,結果表明藍莓中的miRNA與葡萄中的miRNA親緣關系較近,藍莓已知miRNA的保守性很高。3.為了探究藍莓miRNA在藍莓果實發(fā)育中的作用,對測到的100個miRNA根據(jù)其表達量進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)藍熟期與白熟期相比,共68個miRNA上調(diào)表達,推測這些miRNA可能在藍莓果實的發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮作用。4.利用stem-loop qPCR和qRT-PCR方法分析了6個miRNA和其靶基因在藍莓果實發(fā)育的不同時期的表達模式,結果顯示這6個mi RNA和它們的靶基因表達模式呈負相關,表明這6個miRNA通過負向調(diào)控它們的靶標,實現(xiàn)對藍莓果實的發(fā)育和成熟的調(diào)控作用。5.GO分析發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因參與了生物學進程(biologic process)、細胞組分(cellular component和分子功能(molecular function)等過程。6.成功將VcMIR156通過農(nóng)桿菌介導的方法在藍莓中進行過量表達,PCR結果證明VcMIR156已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)到藍莓基因組中。qRT-PCR結果表明與野生型藍莓相比,轉(zhuǎn)基因藍莓中藍莓pre-miR156的表達量明顯升高,而VcMIR156的6個靶基因在轉(zhuǎn)基因藍莓中表達量顯著降低,由此證明我們轉(zhuǎn)入的基因可以正常表達,并行使功能。這些研究結果不僅為全面理解藍莓果實成熟調(diào)控網(wǎng)絡提供新思路,而且為藍莓miRNAs的功能研究奠定了基礎。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S663.9
【部分圖文】：

iRNA起源于基因間隔區(qū)的非編碼區(qū)域，在級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA 具結構[8,9]。之后 pri-miRNA 經(jīng) DCL1 酶（NASTIC LEAVES1），C2H2 鋅脂蛋白BC 協(xié)同作用下形成具有發(fā)卡結構的 pre-A極不穩(wěn)定，進一步被DCL1和HYL1切。隨后，在 miRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 HEN1（最后一個核苷酸發(fā)生甲基化以提高其穩(wěn)定A*復合體依賴 HASTY 轉(zhuǎn)運體從細胞核NA：miRNA*復合體中 miRNA 鏈選擇性，形成 miR-RISC 復合體，并進行靶基NA*鏈隨后被降解[12]。

苷生物合成途徑大體相同，但中間產(chǎn)物和反應底物存在飛燕草素，而在牽�；ㄖ胁荒苄纬商祗每爻煞忠泊嬖诓町悾@些都是由于基因選擇性表達苷的前體都是丙二酰-COA。植物體內(nèi)花青苷生物段：首先苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（PAL）的酸羥化酶（CH4）作用下合成 4-香豆酰 COA，隨后合成酶的催化下合成查爾酮，經(jīng)黃烷酮-3-羥化酶，此過程在花青苷和成過程中起到關鍵作用[23]。（DFR）將二羥黃酮醇還原為無色飛燕草素，無無色原花青苷素；之后原花青苷素在花青苷糖基轉(zhuǎn)基化，甲基化，羥基化修飾等，此過程在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移酶（GST）協(xié)同作用下將花青苷轉(zhuǎn)運到液泡。

圖 2.1 不同長度的 miRNA 在兩個文庫中的 reads 數(shù)Fig.2.1 Reads numbers of miRNAs in different lengths in two libraries為了進一步發(fā)掘藍莓 miRNA 的功能，我們也構建了藍莓果實白熟期和成熟期降解組文庫，最終在這兩個文庫中依此測得10686450和13702581個raw reads。大約4.49M和4.96M條序列可以匹配到藍莓參考序列中（藍莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和EST是數(shù)據(jù)庫），其中超過 55%測得的序列可以匹配到藍莓 cDNA 數(shù)據(jù)庫（表 2.6）。

【參考文獻】

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本文編號：2830185