火龍果(Hylocereus undatus)是一種營養(yǎng)豐富,富含多種有益物質(zhì)的仙人掌科量天尺屬植物。海南地區(qū)因其光照與氣候條件的優(yōu)勢,尤為適宜火龍果的種植,然而每年的5月至11月是海南地區(qū)臺風(fēng)多發(fā)的季節(jié),而臺風(fēng)等因素會導(dǎo)致洪澇災(zāi)害的發(fā)生,進(jìn)而導(dǎo)致土壤含水量增高,當(dāng)含水量超過田間持水量時就會造成火龍果的淹水脅迫,影響火龍果的正常生長發(fā)育,不利于火龍果生產(chǎn)。因此,本研究以火龍果品種“臺灣大紅”為遺傳材料,一方面對其進(jìn)行淹水脅迫處理,在不同的淹水時間取樣,測定與淹水脅迫相關(guān)的SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、葉綠素含量、根系活力等7項(xiàng)生理生化指標(biāo)以及其形態(tài)學(xué)指標(biāo),進(jìn)行不同淹水脅迫不同時長的樣品之間的差異比較及動態(tài)分析,探索淹水脅迫對火龍果的宏觀影響；另一方面運(yùn)用新一代高通量RNA-Seq測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,構(gòu)建不同淹水時長樣品的數(shù)字表達(dá)譜,通過生物信息學(xué)的分析比較研究,篩選出與淹水脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因,克隆對淹水脅迫響應(yīng)相關(guān)的重要基因,探究火龍果對淹水脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果如下:1、火龍果苗的不定根在脅迫0～10 d顯著變短,須根在淹水脅迫30 d時明顯減少;側(cè)莖在脅迫30～40 d開始出現(xiàn)褶皺,發(fā)生萎蔫;主莖基部在脅迫30～40d開始出現(xiàn)病斑,40～50 d開始腐爛,表明火龍果扦插苗對淹水脅迫有一定的耐受性,淹水生境對火龍果產(chǎn)生的影響最先作用于其根系。2、淹水脅迫后,火龍果的SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量顯著增加,葉綠素含量基本保持不變,根系活力顯著降低,表明火龍果能夠通過調(diào)節(jié)其體內(nèi)某些生理物質(zhì)來抵御逆境對其產(chǎn)生的影響,增強(qiáng)火龍果對淹水脅迫的抗性。3、通過RNA-Seq測序,未經(jīng)淹水脅迫處理的火龍果根系樣本CK1、CK2、CK3淹水脅迫3 h后的火龍果根系樣本FR1、FR2、FR3分別獲得的clean reads條數(shù)為66469530(89.15%)、66858484(89.59%)、66364154(88.87%)、66947570(89.70%)、66976684(89.73%)、63525616(89.59%)條。經(jīng)組裝、聚類去冗余后分別獲得26466、25983、25780、26331、29186、23138 個 Unigenes,分別占 50.20%,49.29%,48.90%,49.95%,55.36%,43.89%。其平均長度為 731.26 bp,N50 為 1792。4、通過與 Nr、Nt、GO、KOG、KEGG、SwissPprot 和 InterPro 七大數(shù)據(jù)庫比對上的 Unigene 數(shù)分別為 71.43%,46.00%,41.03%,57.00%,53.43%,48.55%,61.37%。其中,被七大數(shù)據(jù)庫中所有數(shù)據(jù)庫注釋上的Unigene總數(shù)及比例分別為11357和21.54%。被七大數(shù)據(jù)庫中任意一個數(shù)據(jù)庫注釋上的Unigene總數(shù)及比例分別為39239和74.43%。在Nr、KOG、KEGG、SwissProt以及InterPro五大數(shù)據(jù)庫中均被注釋到的有19763個Unigene基因。比對KOG數(shù)據(jù)庫得25個功能組,涉及一般功能預(yù)測的蛋白數(shù)量最多,涉及信號傳導(dǎo)機(jī)制的次之;與GO數(shù)據(jù)庫比對,其功能分布主要富集于新陳代謝途徑和催化活性。5、將FR組與CK組的基因的表達(dá)量進(jìn)行差異比較分析,當(dāng)差異倍數(shù)為2時,共有1481個差異表達(dá)基因,其中有925個基因上調(diào),556個基因下調(diào);當(dāng)所選取的基因表達(dá)量差異倍數(shù)為3時,共有965個差異表達(dá)基因,其中有637個基因上調(diào),328個基因下調(diào);當(dāng)基因表達(dá)量差異倍數(shù)為4時,共有535個差異表達(dá)基因,其中有379個基因上調(diào),156個基因下調(diào),其功能大多集中于糖代謝、氮代謝、乙醇代謝等方面。此外,一些能夠編碼轉(zhuǎn)錄因子以及一些與激素相關(guān)的基因在不同處理間的表達(dá)量差異也較為明顯。6、通過FR組與CK組火龍果中的差異表達(dá)基因GO富集分析,可知差異表達(dá)基因富集在代謝途徑中的single-organism metabolic process和催化活性中的pyruvate decarboxylase activity、thiamine pyrophosphate binding 等方面。通過差異表達(dá)基因pathway富集分析,可知差異表達(dá)基因富集在phenylalanine代謝,stilbenoid、diarylheptanoid and gingerol 生物合成、ubiquinone and other terpenoid-quinone 生物合成等途徑,與能量代謝、氨基酸生物合成、乙烯代謝、ROS代謝等代謝途徑、次生代謝物合成以及與衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因數(shù)較多,表明這些差異表達(dá)基因很有可能與植物淹水脅迫下的應(yīng)答機(jī)制有關(guān)。7、據(jù)預(yù)測,具有編碼TF能力的Unigene有1600個,其中MYB、MYB-related、WRKY、AP2-EREBP、bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子較多,分別為190、149、100、125、117個,NAC和C3H家族的TF分別為70和88個。當(dāng)差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)為4時,差異表達(dá)基因中編碼WRKY、MADS、bHLH、AP2-EREBP等TF的基因數(shù)較多,這些TF可能參與了火龍果應(yīng)對淹水逆境所形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。8、結(jié)合相關(guān)報道、生理指標(biāo)數(shù)據(jù)以及KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果,挑選出26個可能與淹水脅迫相關(guān)的酶的Unigenes進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明測序結(jié)果與預(yù)測結(jié)果相符,并挑選出 Glucose-6-phosphateisomerase、Ribosome-bindingATPaseYchF、Ethylene-responsive transcription factor 1B、Ethylene receptor 2、Ethylene insensitive 3、Cytochrome P450 87A3、LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase FLS2、Squalene synthetase、WRKY transcription factor 3等可能對淹水脅迫敏感的基因準(zhǔn)備進(jìn)行深入挖掘與研究。9、選取了 Unigene15627_A11和CL2218.Contigl_A11兩個在植物淹水脅迫中表達(dá)差異較為顯著的,且與淹水脅迫密切相關(guān)的基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,以為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S667.9
【部分圖文】：

圖２。逡逑ｒｅａｄｓ邋過濾，獲得邋ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ。逡逑

Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑（２）信息分析流程逡逑分析過程如下，完整的分析流程圖見圖２。逡逑①ｒｅａｄｓ邋過濾，獲得邋ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ。逡逑②對ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ進(jìn)行組裝得到Ｕｎｉｇｅｎｅ。逡逑③對Ｕｎｉｇｅｎｅ進(jìn)行功能注釋、ＳＳＲ檢測。逡逑④計算每個樣品Ｕｎｉｇｅｎｅ表達(dá)水平。逡逑⑤差異表達(dá)基因的檢測及深入分析。逡逑１７逡逑

Ｕｎｉｇｅｎｅ分為兩部分，一部分是ｃｌｕｓｔｅｒｓ，是進(jìn)一步聚類去冗余后的結(jié)果，以ＣＬ逡逑開頭后面接基因家族的編號。其余的是ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ，指沒有聚類、單獨(dú)的Ｕｎｉｇｅｎｅ，以逡逑Ｕｎｉｇｅｎｅ開頭。組裝流程見

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本文編號：2830172