由水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白葉枯病(Bacterial blight,BB)是世界上分布最廣、危害最嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性病害之一,嚴(yán)重影響著水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)。多年的科學(xué)研究與生產(chǎn)實踐證明,種植抗病品種是控制水稻白葉枯病最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施。序列特異性核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)是近年發(fā)展起來的作物性狀改良策略,而CRISPR/Cas9系統(tǒng)被認(rèn)為是SSNs最便捷、有效的編輯方法。本研究利用CRSIPR/Cas9系統(tǒng)多靶點編輯水稻功能未知基因Xig1(Xoo induced gene,Xig),以提高水稻白葉枯病抗性并進(jìn)行基因功能研究,獲得的主要結(jié)果如下:1.通過實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)對感白葉枯病秈稻品種IR24和野生稻基因?qū)胂礧6023中的Os11g39100基因進(jìn)行相對表達(dá)量的分析以驗證實驗室前期結(jié)果,相對表達(dá)量分析顯示該基因在IR24中表達(dá)量較高,而在W6023中幾乎不表達(dá),且該基因在IR24中受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)。此結(jié)果與實驗室前期RNA-Seq結(jié)果一致,將此基因暫時命名為Xig1。2.利用PCR方法克隆了Xig1基因,IR24和W6023中Xig1基因的DNA序列長度均為612bp,僅含一個外顯子。在核苷酸序列上存在3個SNPs,氨基酸序列上導(dǎo)致2個氨基酸替換。IR24中該基因的啟動子區(qū)與秈稻材料蜀恢498的相應(yīng)序列完全一致,并對啟動子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行了分析。3.利用煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)觀察到融合有熒光蛋白的XIG1位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上,同時表明Xig1在植物細(xì)胞中是可表達(dá)的。4.構(gòu)建靶向IR24中Xig1的三靶點CRISPR/Cas9載體,共得到T_0代轉(zhuǎn)基因陽性植株31株。經(jīng)過自交和分子鑒定,獲得目標(biāo)基因修飾的T_2代基因編輯純合株系17個。篩選到其中8個T-DNA free株系,在T_3代進(jìn)行了白葉枯病的接種鑒定;結(jié)果顯示,與成株期野生型相比,8個株系在接種后1周和2周的病斑長度明顯縮短,縮短長度在40%-50%。上述8個株系的主要農(nóng)藝性與野生型相比均沒用明顯的差異。綜上所述,本研究克隆到一個白葉枯病感病相關(guān)基因,并獲得了8個水稻白葉枯病抗性顯著提高的抗病資源材料。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.111.47
【部分圖文】：

院碩士學(xué)位論文 Kandavelou et al, 2009），利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異 DNA 序列，再2005 年，Urnov 等發(fā)現(xiàn)了一對由 4 個鋅指連接而成的 ZFNs，這對 ZFN序列，由此科學(xué)家展開了 ZFN 在基因組編輯中的應(yīng)用（Urnov et al, 20一般包含 3-4 個鋅指（Zinc finger, ZF）結(jié)構(gòu)，可以特異識別 9-12bp 的基因組進(jìn)行編輯需要 ZFN 單元形成二聚體才能產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（K域為核酸內(nèi)切酶 FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域（Urnov et al, 2010）。ZFN 技術(shù)意圖如圖 1 所示。FN 已應(yīng)用于果蠅（Wang et al, 2012）、人類干細(xì)胞（Bao et al, 2014. 豬（Yu et al, 2011）、牛（Menoret et al, 2010）、大鼠（Zhang et al, 2l, 2005）、擬南芥（Curtin et al, 2011）、大豆（Bonas et al, 1989）等生由于 ZFN 的構(gòu)建難度比較大、成本高、耗時長、篩選效率低等不足，發(fā)展這項技術(shù)在生物學(xué)研究中日漸被取代。

圖 2. TALEN 靶向切割 DNA 示意圖（周想春等，2016）Fig. 2 Principle of TALEN cleave DNA（周想春等，2016）CRISPR 技術(shù)簡介87 年 CRISPR 最早被日本大阪的研究人員發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌基因組中（Ishino et al直到 2002 年國際上才將這種不同尋常的 DNA 片段被正式命名為 CRISPR（JanCRISPR/Cas 系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠特異性的 DNA 片段并將其敲除，以保證自身遺傳物質(zhì)的保守性。CRISPR 表示成簇的規(guī)文重復(fù)序列，Cas 則是一種和 CRISPR 系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，其作用是特異的識進(jìn)行靶向切割。當(dāng)這類細(xì)菌或古細(xì)菌被外源 DNA 入侵時，CRISPR 系統(tǒng)能夠捕一段特定的核苷酸序列，并將這段核苷酸序列整合到 CRISPR 系統(tǒng)的重復(fù)序列的當(dāng)此外源 DNA 再次入侵時，CRISPR 系統(tǒng)就會在該位點產(chǎn)生一種與入侵基因組特的 crRNA（CRISPR-derived RNA），在 crRNA 的引導(dǎo)下 Cas 蛋白會靶向切割外源達(dá)到抵御外源 DNA 入侵的目的（Ishino et al, 1987）。CRISPR/Cas 系統(tǒng)有 3 種類型和 III 型（Makarova et al, 2011. Reeks et al, 2013）。I 型和 III 型系統(tǒng)較為復(fù)雜蛋白形成復(fù)合體來切割 DNA 雙鏈。而目前應(yīng)用最為廣泛的 II 型的 CRISPR/Cas 系 Cas9 蛋白核酸酶就能實現(xiàn)對 DNA 雙鏈的切割（Chylinski et al, 2014）。

圖 3. CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向切割 DNA 示意圖（周想春等，2016）Fig. 3 Principle of CRISPR/Cas9 system cleave DNA（周想春等，2016）1.2.3 CRISPR 技術(shù)的優(yōu)勢CRISPR 技術(shù)自問世以來，就在生命科學(xué)界掀起熱潮，由于其精確度高、成本低的優(yōu)勢 CRISPR 的蹤跡幾乎遍布了世界各生命科學(xué)實驗室。作為一項先進(jìn)且普及的術(shù)，CRISPR 技術(shù)已連續(xù)三次入選 Science 雜志年度十大突破，該雜志認(rèn)為以 CRIS基因編輯技術(shù)，勢必對生命科學(xué)的研究產(chǎn)生革命性影響。與 ZFN、TALEN 等基因

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本文編號：2830583