心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是缺血性心臟病中最為嚴(yán)重的疾病之一。C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)是一類急性反應(yīng)蛋白,是心血管疾病中重要的炎癥標(biāo)記物,但其在心血管疾病進(jìn)程中的作用尚屬未知。本研究擬通過在H9c2心肌細(xì)胞和大鼠心肌缺血模型中沉默CRP基因,通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索CRP基因是否調(diào)控心肌缺血過程中的重要因子miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1,了解缺血過程中心肌損傷的全新的分子機(jī)理。體外實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)并構(gòu)建三組特異性沉默CRP基因的慢病毒載體和一組無敲減作用的對(duì)照組慢病毒載體,篩選出沉默CRP基因效率最佳的慢病毒載體。通過MTT實(shí)驗(yàn)分析CRP沉默組和對(duì)照組中H9c2心肌細(xì)胞的活性,并以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CRP基因沉默后H9c2心肌細(xì)胞中miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達(dá)情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):隨機(jī)選取野生型與CRP敲除型雄性SD大鼠各8只,分別設(shè)為假手術(shù)組和手術(shù)組(每組4只)。通過結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈建立心肌缺血模型,缺血50 h后收集心臟組織并制作冰凍切片,根據(jù)病理染色后心肌細(xì)胞形態(tài)的完整性區(qū)分并捕獲假手組、手術(shù)組正常區(qū)和缺血區(qū)的心肌細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠不同組別中各區(qū)域的miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表達(dá)情況。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CRP沉默后H9c2心肌細(xì)胞活性(0.78±0.030)顯著高于對(duì)照組(0.66±0.010,P0.05)。同時(shí),CRP沉默后miR-21的水平顯著上調(diào)并高于對(duì)照組(P0.01),相應(yīng)的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1的表達(dá)水平相應(yīng)下調(diào)并顯著低于對(duì)照組(P值均小于0.001)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,CRP敲除后假手術(shù)組大鼠的正常心肌細(xì)胞中miR-21水平顯著高于野生型假手術(shù)組(P0.05),其所抑制的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1表達(dá)水平相應(yīng)地低于野生型假手術(shù)組,與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在心肌缺血模型中,與相應(yīng)的假手術(shù)組相比,野生型和CRP敲除型手術(shù)組缺血區(qū)的miR-21表達(dá)水平均上調(diào),但CRP敲除后手術(shù)組缺血區(qū)miR-21水平由于基線較高,上調(diào)的幅度低于野生型大鼠。相應(yīng)地,CRP敲除可以增加miR-21下游基因PDCD4和PTEN在假手術(shù)組和手術(shù)組缺血心肌中的表達(dá)差異。本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致證明了CRP可以調(diào)控心血管疾病進(jìn)程中的重要因子miR-21及其下游靶基因的表達(dá)。在大鼠心肌缺血模型中研究CRP敲除對(duì)miR-21及其靶基因的調(diào)控方式,推測(cè)CRP敲除對(duì)缺血心肌具有與缺血預(yù)適應(yīng)相似的保護(hù)作用,提示CRP可能是開發(fā)新型藥物治療缺血性心血管病的潛在作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

1-1 miR-21 及其靶基因在心肌梗死過程中的重要調(diào)控作意義和內(nèi)容目的是通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索 CRP 是否通過調(diào)控心1 及其靶基因 PDCD4、PTEN 和 Spry1 來影響心肌缺血體外實(shí)驗(yàn)中，研究 CRP 基因沉默對(duì) H9c2 大鼠心肌細(xì)PTEN 和 Spry1 mRNA 的調(diào)控作用，以及對(duì)細(xì)胞增殖能，研究 CRP 基因敲除是否調(diào)控大鼠缺血心肌細(xì)胞中 mPTEN 和 Spry1 mRNA 的表達(dá)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期的表iR-21 及其靶基因的調(diào)控影響心肌缺血和心肌梗死的病血管疾病中致死率最高的疾病之一，在心肌梗死過程中

助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，在細(xì)胞中完成慢病毒的包裝，離心濃縮收集高滴度的病毒顆粒。包裝好的慢病毒顆粒可以直接用于宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，在細(xì)胞質(zhì)中被其自身攜帶的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)為 DNA，形成 DNA 整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA 整合到宿主細(xì)胞基因組中。整合后的 DNA 可以轉(zhuǎn)錄成 siRNA 前體，再運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，被酶剪切形成 siRNA，產(chǎn)生 RNA 干擾以沉默相應(yīng)的目的基因。本實(shí)驗(yàn)所用的 shRNA 干擾慢病毒載體由慢病毒基因組序列和細(xì)菌質(zhì)粒序列構(gòu)成，如圖 2-1 所示。細(xì)菌質(zhì)粒序列含有一個(gè) Ampicillin 抗性基因和一個(gè)高拷貝復(fù)制子 pUCori。慢病毒基因組序列是從元件 5’LTR 開始，到 3’LTR 結(jié)束。慢病毒基因組序列可容納兩個(gè)外源基因表達(dá)盒子：一個(gè)是目的基因表達(dá)盒子，另外一個(gè)是 marker 基因 EGFP 表達(dá)盒子。Marker 基因 EGFP 表達(dá)盒子已經(jīng)克隆在載體上，無需重新構(gòu)建。目的基因表達(dá)盒子則包括三部分序列：U6 啟動(dòng)子、CRP shRNA 和終止子。U6 啟動(dòng)子已經(jīng)克隆在載體上，構(gòu)建載體只需通過 annealing-ligation 技術(shù)將 CRP 基因的 shRNA 和終止子克隆到載體上即可。

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有比較采用 t 檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著泳鑒定結(jié)果達(dá)載體質(zhì)粒為 pLV.shRNA.P/E基片段后，獲得的目的片段大2-2），結(jié)果顯示目的片段的位

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉宇;楊娟;韋婷;羅煜;孟憲麗;曾勇;;改良冠脈結(jié)扎法大鼠心肌缺血模型的制備[J];中藥藥理與臨床;2015年06期

2 徐銘;;大鼠心肌梗死模型制作的影響因素[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2012年02期

本文編號(hào)：2828761