大腸桿菌是一種重要的食源性致病菌,具有廣泛的宿主性,可導(dǎo)致人畜共患病,其成為危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的病原菌之一,尤其是大腸桿菌在種蛋孵化過(guò)程中能引起鴨胚的死亡,而且容易造成大面積感染,對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。本論文為研究死亡鴨胚中病原菌的感染狀況,以探究鴨胚在孵化過(guò)程中的死亡原因;通過(guò)藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè),初步掌握鴨胚源大腸桿菌耐藥及耐藥基因的攜帶情況;通過(guò)對(duì)鴨胚源大腸桿菌攜帶毒力基因的檢測(cè)及ETT2毒力島類型的分析,探討鴨胚源大腸桿菌的致病性。本研究共分五部分。(1)死亡鴨胚中細(xì)菌的分離鑒定通過(guò)對(duì)無(wú)破損的死亡鴨胚進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、16SrDNA鑒定等方法,從415枚鴨胚中共分得細(xì)菌370株,分屬27個(gè)種,其中324枚存在細(xì)菌感染,感染率為78.1%。在分離的所有細(xì)菌中,大腸桿菌和沙門(mén)氏菌分別占33.2%和25.4%,是死亡鴨胚中的主要菌群。結(jié)果表明,造成種鴨孵化場(chǎng)胚胎死亡率和弱雛率明顯升高的主要原因是細(xì)菌感染所致,并且大腸桿菌是主要的致病菌之一。(2)鴨胚源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的紙片法(Kirby-Baure法)對(duì)123株鴨胚源大腸桿菌進(jìn)行18種抗生素(氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物、β-內(nèi)酰胺類藥物等)的耐藥性檢測(cè)。結(jié)果顯示,123株大腸桿菌對(duì)18種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥:β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性最高,頭孢氨芐耐藥率為82.9%,氨芐西林的耐藥率為77.2%,頭孢噻吩耐藥率72.4%;喹諾酮類藥物耐藥率較高,環(huán)丙沙星為54.5%,諾氟沙星耐藥率為49.6%,左氧氟沙星耐藥率為48%;氨基糖苷類藥物耐藥率較低,其中鏈霉素的耐藥率最高為39.0%,其次是卡那霉素為30.9%,最低為慶大霉素,耐藥率為10.6%;其他類藥物中耐藥率最低的為多粘菌素B,耐藥率為13.8%。該項(xiàng)研究調(diào)查表明,在治療和預(yù)防泰安地區(qū)種鴨孵化場(chǎng)致病性細(xì)菌感染時(shí)可以選擇性配合使用氨基糖苷類藥物和多粘菌素B。(3)鴨胚源大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)與鑒定對(duì)鑒定的123株鴨胚源大腸桿菌進(jìn)行氨基糖苷類鈍化酶基因三重PCR檢測(cè),結(jié)果顯示123株大腸桿菌中耐藥基因ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib和aph(3’)-IIa攜帶率分別為22.8%、3.3%和2.4%。16S甲基化酶基因的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,123株鴨胚源大腸桿菌中耐藥基因armA、rmt A和rmtB的攜帶率分別為95.1%、19.5%和0.8%。喹諾酮類耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果表明,qnrD、qnrS、oqxA和oqxB的攜帶率分別為11.4%、22.0%、22.0%和15.4%,而qnrA、qnrB和qnrC未檢出。β-內(nèi)酰胺類耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,123株大腸桿菌中50株攜帶有TEM型β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因,基因攜帶率40.7%。(4)鴨胚源大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)與鑒定對(duì)123株鴨胚源大腸桿菌進(jìn)行了18種毒力基因的多重PCR檢測(cè),分離強(qiáng)毒株42株,占比34.1%。其中yijp、fimC、iss、ibeB、ompA五種基因有非常高的檢出率,此項(xiàng)調(diào)查為禽致病性大腸桿菌的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和研究提供了理論依據(jù)。本研究對(duì)123株鴨胚源大腸桿菌進(jìn)行了ETT2毒力島的PCR檢測(cè),結(jié)果顯示其中100株攜帶有ETT2毒力島,檢出率為81.3%。123株鴨胚源大腸桿菌的ETT2毒力島共分為A~K 11個(gè)類型,其中包括1個(gè)完整型和10個(gè)不同程度的缺失型。其中B型和C型的ETT2毒力島檢出率最高,檢出率分別為31.7%(39株)和26.8%(33株)。此項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)ETT2毒力島在鴨胚源大腸桿菌的分布情況進(jìn)行調(diào)查,為進(jìn)一步研究ETT2毒力島在鴨胚源大腸桿菌中的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.612
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 大腸桿菌
        1.1.1 大腸桿菌病
        1.1.2 病原特性
    1.2 大腸桿菌的檢測(cè)方法
        1.2.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)
        1.2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)
        1.2.3 死活菌檢測(cè)技術(shù)
        1.2.4 其他新型檢測(cè)技術(shù)
    1.3 大腸桿菌的耐藥性
        1.3.1 細(xì)菌的耐藥機(jī)制
        1.3.2 大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀
    1.4 大腸桿菌毒力因子
        1.4.1 黏附素
        1.4.2 鐵攝取系統(tǒng)
        1.4.3 保護(hù)素
        1.4.4 侵襲素IbeA
        1.4.5 毒素
    1.5 毒力島
        1.5.1 毒力島的特征
        1.5.2 毒力島的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.5.3 大腸桿菌中的毒力島
    1.6 本研究的目的意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病料來(lái)源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 分子生物學(xué)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
        2.1.5 引物合成
    2.2 方法
        2.2.1 死亡鴨胚中細(xì)菌的分離鑒定
        2.2.2 鴨源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)
        2.2.3 鴨源大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)與鑒定
        2.2.4 鴨源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)與鑒定
        2.2.5 鴨源大腸桿菌ETT2毒力島類型分析
3 結(jié)果
    3.1 死亡鴨胚中細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果
        3.1.1 革蘭氏染色結(jié)果
        3.1.2 16SrDNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
        3.1.3 16SrDNA測(cè)序結(jié)果
        3.1.4 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)特性
    3.2 鴨胚源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 部分細(xì)菌藥敏試驗(yàn)生長(zhǎng)狀況
        3.2.2 鴨胚源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
    3.3 鴨胚源大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.3.1 耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
        3.3.2 氨基糖苷類鈍化酶基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.3.3 16S甲基化酶基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.3.4 喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.3.5 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.3.6 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
    3.4 鴨源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)與鑒定結(jié)果
        3.4.1 毒力基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果
        3.4.2 毒力基因檢測(cè)與鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果
        3.4.3 強(qiáng)毒株毒力基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果
    3.5 鴨源大腸桿菌ETT2毒力島類型分析結(jié)果
        3.5.1 ETT2毒力島PCR擴(kuò)增產(chǎn)物部分電泳結(jié)果
        3.5.2 ETT2毒力島類型統(tǒng)計(jì)結(jié)果
4 討論
    4.1 死亡鴨胚中細(xì)菌的流行狀況
    4.2 鴨胚源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)檢測(cè)
    4.3 鴨源大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)
    4.4 鴨源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)
    4.5 鴨源大腸桿菌ETT2毒力島類型分析
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝

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