發(fā)布時(shí)間：2020-09-28 13:10

　　 隨著石油等不可再生資源的消耗殆盡,迫使人們將目光投向其他可再生資源的開發(fā)利用。纖維素是地球上最豐富的可再生資源,如何將其轉(zhuǎn)化為可直接使用的能源是人類解決能源危機(jī)的重要途徑之一。Cytophaga hutchinsonii是一種能夠高效地降解結(jié)晶纖維素的革蘭氏陰性細(xì)菌,它的降解機(jī)制與其他纖維素降解微生物不同。通過分析Chutchinsoni.的基因組序列,發(fā)現(xiàn)它有9個(gè)纖維素內(nèi)切酶,其中5個(gè)位于細(xì)胞表面,本文通過基因敲除的方法,在表面纖維素酶四敲菌株CH581的基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除Ce19D,研究了表面纖維素酶在Chutchinson.降解纖維素的過程中所起的作用。同時(shí),利用轉(zhuǎn)座子插入突變的方法篩選到一個(gè)影響纖維素降解的關(guān)鍵基因,并對其功能進(jìn)行了研究。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.C hutchinsonii中位于細(xì)胞表面的纖維素酶的作用研究Chutchinson.中5個(gè)位于細(xì)胞表面的內(nèi)切纖維素酶分別是Ce15A、Ce19A、Ce19B、Ce19D和Ce19E。2016年,朱永濤等構(gòu)建了C.hutchinsonii表面內(nèi)切酶四敲菌株,將Ce15A、Ce19A、Ce19B以及Ce19E全部敲除,只剩Ce19D未能敲除,此菌株(CH581)能夠利用纖維素作為碳源生長。我們在此基礎(chǔ)上,成功將定位于細(xì)胞表面的最后一個(gè)內(nèi)切纖維素酶Ce19D敲除,并將此菌株命名為CH681。發(fā)現(xiàn)Ce19D敲除后,突變株CH681能夠利用纖維素作為碳源生長,但是在濾紙平板上的降解圈要明顯小于野生型。在液體中的生長曲線分析發(fā)現(xiàn)其在葡萄糖和纖維二糖中的生物量不能達(dá)到野生型的水平,但對底物利用沒有延遲,而在再生無定型纖維素(Regenetated amorphous cellulose,RAC)和微晶纖維素Avicel中生長明顯延遲,說明其底物利用速率減慢,這一點(diǎn)從纖維素粉的底物利用速率上也可以看出來。同時(shí)我們在檢測細(xì)胞表面的內(nèi)切酶酶活時(shí)發(fā)現(xiàn),表面內(nèi)切纖維素酶缺失后酶活明顯降低,說明敲除的這幾個(gè)酶是表面酶活的主要來源。但是表面仍有部分酶活存在,這剩余的酶活是如何如產(chǎn)生的?通過分析我們發(fā)現(xiàn)了四個(gè)預(yù)測定位于細(xì)胞表面的糖苷酶,分別是bglE、bglF、bglG和bglI,糖苷酶的底物具有非專一性,是否是由于它們的存在而導(dǎo)致了剩余酶活的存在。因此,我們首先通過qPCR檢測了突變株與野生型中這幾個(gè)糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化,發(fā)現(xiàn)它們的轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的提高,特別是bglI差異倍數(shù)最為明顯,提高了 9倍左右。因此,我們分別設(shè)計(jì)這幾個(gè)糖苷酶的單敲除和CH681基礎(chǔ)上的連續(xù)敲除,檢測這幾個(gè)糖苷酶在纖維素降解過程中是否發(fā)揮了作用。首先,將它們分別單敲除以后發(fā)現(xiàn)每個(gè)突變株的濾紙降解能力并沒有明顯的變化,說明某一個(gè)糖苷酶的缺失并不會(huì)對纖維素降解產(chǎn)生影響,而循環(huán)敲除工作還剩bglG未進(jìn)行敲除,初步對CH685菌株(CH681基礎(chǔ)上敲除bglE、bglF、bglH和bglI)的表型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),其濾紙降解速率減慢,通過酶活測定發(fā)現(xiàn),其內(nèi)切酶酶活與CH681菌株相比有所降低。說明細(xì)胞表面糖苷酶的缺失對濾紙降解以及酶活也有部分影響但并不是主要的。2.基因chu_hypZ1的功能研究本部分通過轉(zhuǎn)座子插入突變的方法篩選到一株不能在濾紙平板上生長的菌株,定位插入位點(diǎn)是一個(gè)未知功能基因,我們將它定義為chu_hypZ1。敲除chu_hypZ1后獲得突變株△hypZ1,它不能夠利用纖維素,通過基因回補(bǔ),能夠使其表型恢復(fù),說明表型缺陷是由chu_hypZ1的缺失所致。RT-PCR顯示△hypZ1中chu_hypZ1的鄰近基因的轉(zhuǎn)錄未受到chu_hypZ1敲除的影響。CHU_hypZ1的功能未知,Blast P比對發(fā)現(xiàn)與其相似的蛋白均為未知功能蛋白,且其中有些屬于噬纖維菌屬,說明了此蛋白在進(jìn)化中的保守性。突變株△hypZ1可以在葡萄糖、纖維二糖和RAC中生長,但是在微晶纖維素Avicel中明顯出現(xiàn)生長缺陷,說明chu_hypZ1的缺失影響了 C.hutchinsonii對纖維素結(jié)晶區(qū)的降解。通過檢測Avicel結(jié)晶度的變化也進(jìn)一步證實(shí)了chu_hypZ1是一個(gè)與結(jié)晶區(qū)降解相關(guān)的基因。突變株△hypZ1的細(xì)胞表面內(nèi)切酶酶活明顯降低,通過我們的研究發(fā)現(xiàn)這一方面是由這些內(nèi)切酶的轉(zhuǎn)錄水平降低所致,另一方面位于細(xì)胞表面的內(nèi)切酶不能正常定位于外膜也是原因之一。此外,突變株的外膜蛋白以及外膜吸附蛋白與野生型相比缺失了幾個(gè)條帶,經(jīng)過鑒定其中多為未知功能蛋白,另外有兩個(gè)屬于Ⅸ型分泌系統(tǒng)的組分蛋白,是否chu_hypZ1的缺失對Ⅸ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生了影響?通過檢測Ⅸ型分泌系統(tǒng)的底物蛋白質(zhì)CHU_0344,發(fā)現(xiàn)CHU_0344的條帶可以在突變株的胞外檢測到,說明chu_hypZ1的缺失對Ⅸ型分泌系統(tǒng)并沒有產(chǎn)生影響。通過鑒定胞外的差異蛋白,發(fā)現(xiàn)原本屬于膜上的蛋白卻能夠在胞外檢測到,例如Ce15A以及Bg1F,Ce15A是一個(gè)內(nèi)切酶,而Bg1F正是外膜上缺失的那個(gè)蛋白。因此,我們推測可能chuhypZ1的缺失,導(dǎo)致了一些膜蛋白不能正常錨定于膜上,使得纖維素降解缺陷。本文首先以Chutchinson.獨(dú)特的纖維素酶系分布為切入點(diǎn),發(fā)現(xiàn)盡管細(xì)胞表面有多個(gè)纖維素酶和糖苷酶,但它們對纖維素的降解并不是必需的,只能減緩對纖維素的利用。推測它們可能只是起到了松解無定形區(qū),產(chǎn)生寡糖鏈的作用。同時(shí),篩選到一個(gè)影響纖維素降解的關(guān)鍵基因chuhypZ1,發(fā)現(xiàn)它的缺失導(dǎo)致一些膜蛋白不能正常錨定于細(xì)胞膜上而導(dǎo)致降解缺陷。本文對Chutchinson.表面纖維素酶系以及chu_hypZ1的功能研究,使我們對C.hutchinsonii的纖維素降解機(jī)制有了進(jìn)一步的了解,為實(shí)現(xiàn)纖維素資源的高效利用提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q93;O636.11
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫詞表
第一章 研究背景
    1.1 纖維素資源的開發(fā)利用
    1.2 纖維素的結(jié)構(gòu)
    1.3 纖維素的微生物降解
        1.3.1 纖維素降解微生物
        1.3.2 微生物的纖維素降解機(jī)制
    1.4 纖維素結(jié)晶區(qū)的降解策略
        1.4.1 CBM的作用及分類
        1.4.2 Expansins以Expansin-like proteins
        1.4.3 裂解多糖單加氧酶(LPMOs)
    1.5 Cytophaga hutchinsonii研究背景
        1.5.1 C.hutchinsonii的系統(tǒng)發(fā)育
        1.5.2 C. hutchinsonii的特征
        1.5.3 C.hutchinsonii的研究進(jìn)展
        1.5.4 C.hutchinsonii獨(dú)特的纖維素酶系
    1.6 論文的立題和工作思路
第二章 C.hutchinsonii表面纖維素酶系的作用
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種及質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)中用到的引物
        2.1.3 主要試劑及儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液
        2.1.5 分子生物學(xué)所用反應(yīng)體系及操作
        2.1.6 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備與熱激轉(zhuǎn)化
        2.1.7 C.hutchinsonii感受態(tài)細(xì)胞的制備及電擊轉(zhuǎn)化
        2.1.8 基因敲除
        2.1.9 濾紙降解實(shí)驗(yàn)
        2.1.10 生長曲線測定
        2.1.11 RT-PCR
        2.1.12 RT-qPCR
        2.1.13 纖維素酶活測定
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 表面纖維素酶缺失后菌體能夠利用纖維素
        2.2.2 生長曲線
        2.2.3 表面纖維素酶缺失株的酶活
        2.2.4 表面糖苷酶的缺失不影響對纖維素的降解
        2.2.5 表面糖苷酶的轉(zhuǎn)錄水平
        2.2.6 CH681基礎(chǔ)上敲除糖苷酶后的表型
    2.3 討論
第三章 chu_hypZ1基因功能研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌種及質(zhì)粒
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)中用到的引物
        3.1.3 主要試劑及儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液
        3.1.5 分子生物學(xué)常用反應(yīng)體系及操作
        3.1.6 纖維素降解缺陷株的篩選
        3.1.7 基因敲除
        3.1.8 基因回補(bǔ)與過表達(dá)
        3.1.9 再生無定形纖維素(RAC)的制備
        3.1.10 XRD測定纖維素結(jié)晶度
        3.1.11 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
        3.1.12 C. hutchinsonii各組分蛋白樣品的制備(操作均在4℃下進(jìn)行)
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 濾紙降解缺陷株的獲得
        3.2.2 生物信息學(xué)分析
        3.2.3 chu_atoS與纖維素降解無關(guān)
        3.2.4 chu_hypZ1是纖維素結(jié)晶區(qū)降解相關(guān)基因
        3.2.5 CHU_hypZ1與纖維素結(jié)合無關(guān)
        3.2.6 chu_hypZ1對纖維素酶酶活的影響
        3.2.7 差異蛋白的鑒定
    3.3 討論
全文總結(jié)及展望
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

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