背景心血管疾病是威脅人類生命的最重要的疾病之一。許多研究證實(shí),血管平滑肌細(xì)胞異常增生在心血管疾病中起著關(guān)鍵作用,如動(dòng)脈粥樣硬化和冠脈支架內(nèi)再狹窄。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)在損傷和其它刺激反應(yīng)下,可減少收縮蛋白的表達(dá),增加蛋白的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加,這是血管成形術(shù)后血管再狹窄的主要發(fā)病機(jī)制。然而,血管成形術(shù)后血管再狹窄的分子機(jī)制還不完全清楚。因此,更好地了解這些血管再狹窄的調(diào)節(jié)機(jī)制可能會(huì)指導(dǎo)制定治療心血管疾病的新策略。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA,與特定mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,導(dǎo)致靶基因mRNA的降解。目前在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2,000多種miRNA。MiRNA在包括腫瘤、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)及心血管等許多疾病中起作用,最近的研究發(fā)現(xiàn),miRNA在控制VSMCs增殖和遷移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,例如miR-132、miR-22、miR-379、miR-124等可以抑制VSMCs的增殖和遷移,而miR-214、miR-221/miR-222、miR-146等有促進(jìn)VSMCs增殖和遷移的作用。MiR-93是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的miR-17 microRNA簇,與脊椎動(dòng)物譜系的早期進(jìn)化密切相關(guān)。以前的研究表明miR-93參與了多種疾病,包括癌癥、心肌缺血再灌注和脊髓神經(jīng)元疾病。然而,miR-93是否參與VSMCs增殖還不完全清楚。線粒體融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)是存在于線粒體的一種GTP酶,對(duì)線粒體的融合和功能調(diào)節(jié)有重要的作用,有研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞內(nèi)可以調(diào)控增殖和凋亡,最近的研究證實(shí)Mfn-2可以抑制VSMCs的增殖,因此,本研究擬在建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管狹窄模型的基礎(chǔ)上,探討miR-93是否通過抑制Mfn-2表達(dá)而調(diào)節(jié)血管平滑肌的增殖和遷移。目的通過建立大鼠的頸動(dòng)脈球囊損傷的動(dòng)物模型和細(xì)胞的血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)刺激的細(xì)胞模型,探討miR-93在血管平滑肌中的作用和機(jī)制,為治療和預(yù)防血管形成術(shù)后再狹窄提供新的作用靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。方法1實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)mi R-93在大鼠頸動(dòng)脈損傷模型血管中的表達(dá),qRT-PCR和免疫熒光檢測(cè)miR-93在PDGF-BB刺激的VSMCs中的表達(dá)。2分別敲低動(dòng)物和細(xì)胞miR-93的表達(dá),頸動(dòng)脈病理切片檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈狹窄程度,細(xì)胞四甲基偶氮唑藍(lán)發(fā)(MTT)檢測(cè)、EDU細(xì)胞增殖成像實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖程度,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Transwell實(shí)驗(yàn))檢測(cè)細(xì)胞遷移程度。3 qRT-PCR檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈和VSMCs的Cyclin D1、MMP 2和Mfn-2的mRNA水平的表達(dá)。Western blot法檢測(cè)大鼠頸動(dòng)脈和VSMCs的Cyclin D1、MMP和Mfn2的蛋白水平的表達(dá),Raf和ERK1/2的磷酸化水平。組織和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Mfn-2在組織和細(xì)胞的表達(dá)。4雙熒光素酶報(bào)告基因鑒定mi R-93和Mfn2的3’UTR的結(jié)合。結(jié)果動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,頸動(dòng)脈損傷后大鼠血管平滑肌細(xì)胞MiR-93表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,在用PDGF-BB處理后,在離體培養(yǎng)的VSMCs中觀察到類似的結(jié)果。miR-93的抑制抑制頸動(dòng)脈損傷后的新內(nèi)膜形成。此外,我們的研究結(jié)果表明,miR-93抑制劑能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移,同時(shí)降低MMP2,Cyclin D1的表達(dá)。從機(jī)制分析,我們發(fā)現(xiàn)Mfn2是miR-93的直接靶基因。此外,檢測(cè)Raf和ERK1/2的磷酸化程度發(fā)現(xiàn),miR-93介導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移歸因于Raf-ERK1/2途徑。結(jié)論在本研究中,我們將miR-93鑒定為VSMC增殖,分化和動(dòng)脈損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生的新型調(diào)節(jié)劑。我們報(bào)道m(xù)iR-93通過靶向Mitofusin-2(Mfn2)促進(jìn)VSMCs增殖和遷移,這可能是血管形成術(shù)后再狹窄的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

PsiCHECK-2載體質(zhì)粒圖譜

miR-93在頸動(dòng)脈球囊損傷后第1天、7天、14天和第21天的表達(dá)量（*P<0.05,n=6）;B:miR-93在不同劑量PDGF-BB刺激血管平滑肌細(xì)胞后的表達(dá)量（*P<0.05,n=4）;C:miR-93在PDGF-BB刺激血管平滑肌不同時(shí)間后的表達(dá)量（*P<0.05,n=4）;D:miR-93在血管平滑肌細(xì)胞中原位雜交后的免疫熒光

圖2分別用antagomir-93和antagomir-93control轉(zhuǎn)染大鼠后，觀察大鼠頸動(dòng)脈損傷14天后的情況

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李萍;;血管內(nèi)皮細(xì)胞病理生理作用的研究進(jìn)展[J];微循環(huán)學(xué)雜志;2014年04期

2 賈東煜;王貴學(xué);;血管支架內(nèi)再狹窄相關(guān)因素與機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年35期

3 白融;冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2001年06期

本文編號(hào)：2828143