萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是一種重要的蟲(chóng)生真菌,該真菌可以侵染多種鱗翅目害蟲(chóng)特別是對(duì)夜蛾科害蟲(chóng)具有較高毒力,具有良好的生防應(yīng)用前景。萊氏野村菌需要使用麥芽糖作為碳源和持續(xù)光照才能夠正常產(chǎn)孢。為了解決這一問(wèn)題,本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)使用AM培養(yǎng)基通過(guò)液體培養(yǎng)成功誘導(dǎo)出萊氏野村菌微菌核作為分生孢子的替代品應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治。萊氏野村菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)的發(fā)布為萊氏野村菌基因功能研究提供了基礎(chǔ)。但由于非同源末端連接效應(yīng)的存在使得基因敲除效率極低。因此,目前迫切需要一種更為高效的基因敲除方法應(yīng)用于萊氏野村菌基因功能的研究。論文以建立萊氏野村菌高效的基因敲除體系為基礎(chǔ),通過(guò)基因敲除的方法研究萊氏野村菌過(guò)氧化氫酶基因Nr Cat1和Nr Cat4的功能以及這兩個(gè)基因在微菌核形成過(guò)程中所起的作用。還以基因敲除方法對(duì)過(guò)氧化物酶體膜蛋白Nr Pex16基因進(jìn)行功能研究。研究結(jié)果對(duì)揭示氧代謝及其相關(guān)基因在微菌核形成發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)理具有重要意義,并能夠?yàn)槠湟后w發(fā)酵提供理論指導(dǎo)。研究取得的結(jié)果如下:(1)建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Split-marker高效基因敲除體系1)Split-marker敲除載體的構(gòu)建以線性敲除載體p PZP-hph-knockout為原始載體通過(guò)酶切連接手段構(gòu)建了split-marker敲除載體p PZP-split-marker-A和p PZP-split-marker-B。并將gus基因做為反向篩選標(biāo)記插入到p PZP-split-marker-B載體當(dāng)中,構(gòu)建成p PZP-split-markerB-gus載體。2)Split-marker基因敲除載體的遺傳轉(zhuǎn)化效率和基因敲除效率傳統(tǒng)的Linear cassette方法的轉(zhuǎn)化率為split-marker方法的11倍。分別使用linear cassette方法和split-marker方法敲除萊氏野村菌Nr Cat1,Nr Cat2和Nr Pex16基因,發(fā)現(xiàn)使用linear cassette方法三個(gè)基因的敲除效率分別為1.6%,4.2%和1.0%。使用split-marker方法結(jié)合反向篩選標(biāo)記三個(gè)基因的敲除效率分別為81%,82.3%和64.1%。(2)萊氏野村菌過(guò)氧化氫酶基因Nr Cat1和Nr Cat4的研究1)Nr Cat1和Nr Cat4基因的克隆及序列分析克隆了萊氏野村菌過(guò)氧化氫酶基因Nr Cat1和Nr Cat4。生物信息學(xué)分析顯示:Nr Cat1基因的ORF為2651bp,編碼716個(gè)氨基酸。Nr Cat4基因的ORF為1130bp,編碼385個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)Nr Cat1和Nr Cat4基因所編碼的蛋白質(zhì)均具有過(guò)氧化氫酶超家族特征,并且都具有一個(gè)亞鐵血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域。2)過(guò)氧化氫酶基因Nr Cat1和Nr Cat4在微菌核形成中的作用敲除Nr Cat1和Nr Cat4基因發(fā)現(xiàn)ΔNr Cat1突變體菌株不能有效的形成微菌核結(jié)構(gòu),培養(yǎng)液的色素濃度明顯低于野生型菌株,微菌核的形成時(shí)間也延后;ΔNr Cat4突變體菌株可以形成微菌核結(jié)構(gòu),培養(yǎng)液的色素濃度略高于野生型菌株,微菌核的形成時(shí)間與野生型菌株相比略有提前。結(jié)合過(guò)氧化氫酶基因的時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),Nr Cat1和Nr Cat4基因均參與了微菌核形成過(guò)程中活性氧的調(diào)節(jié)和代謝。以上結(jié)果表明,Nr Cat1和Nr Cat4基因參與應(yīng)對(duì)微菌核形成時(shí)所產(chǎn)生的氧脅迫,這兩個(gè)基因的缺失均會(huì)對(duì)微菌核的形成造成影響。3)過(guò)氧化氫酶基因在萊氏野村菌生長(zhǎng),產(chǎn)孢,萌發(fā)以及抗逆中的作用測(cè)定了過(guò)氧化氫酶敲除突變體在常規(guī)培養(yǎng)基上的萌發(fā)、生長(zhǎng)、產(chǎn)孢以及對(duì)不同脅迫條件下的表征。結(jié)果顯示,ΔNr Cat1突變體菌株的菌絲生長(zhǎng)速率為野生型菌株的1.1倍,產(chǎn)孢量為野生型菌株的82%,突變體菌株的孢子萌發(fā)時(shí)間比野生型菌株提前。這些結(jié)果表明Nr Cat1基因缺失影響了萊氏野村菌的生長(zhǎng),產(chǎn)孢和萌發(fā)。Nr Cat1基因缺失使菌株對(duì)過(guò)氧化氫的耐受能力下降,表明Nr Cat1基因在應(yīng)對(duì)外源過(guò)氧化氫脅迫當(dāng)中具有重要的作用。Nr Cat1和Nr Cat4基因的缺失還造成孢子耐熱性的降低說(shuō)明Nr Cat1和Nr Cat4基因也參與應(yīng)對(duì)熱脅迫。ΔNr Cat1和ΔNr Cat4菌株均對(duì)高滲透壓脅迫不敏感,僅ΔNr Cat1菌株對(duì)剛果紅敏感。4)過(guò)氧化氫酶基因缺失影響萊氏野村菌毒力體壁接種侵染斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的菌株毒力測(cè)試表明,ΔNr Cat1和ΔNr Cat4突變體菌株相比野生型菌株對(duì)斜紋夜蛾的毒力降低,結(jié)合過(guò)氧化氫酶酶活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶酶活性越低菌株的毒力越低。(3)萊氏野村菌過(guò)氧化物酶體膜蛋白基因Nr Pex16的研究1)Nr Pex16基因的克隆及序列分析克隆了萊氏野村菌過(guò)氧化物酶體膜蛋白Nr Pex16基因。Nr Pex16基因全長(zhǎng)ORF為1157bp,編碼385個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白質(zhì)具有Pex16超家族特征。2)Nr Pex16基因在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),孢子萌發(fā),產(chǎn)孢,兩型轉(zhuǎn)化以及抗逆中的作用Nr Pex16基因缺失嚴(yán)重影響了萊氏野村菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。與野生型菌株相比,ΔNr Pex16突變體菌株在SMAY平板培養(yǎng)基上由酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)換的時(shí)間延長(zhǎng),Nr Pex16基因的缺失導(dǎo)致孢子萌發(fā)率下降。ΔNr Pex16菌株抗逆性實(shí)驗(yàn)表明,突變體菌株對(duì)氧脅迫,熱脅迫和細(xì)胞壁破壞劑剛果紅敏感,對(duì)高滲透壓脅迫不敏感。3)Nr Pex16基因?qū)θR氏野村菌脂肪酸代謝的影響ΔNr Pex16突變體菌株可以在以麥芽糖和醋酸鈉為碳源的MM培養(yǎng)基上生長(zhǎng),而不能在以甘油酸三脂,橄欖油和Tween-80為碳源的MM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。4)Nr Pex16基因缺失影響萊氏野村菌毒力體壁侵染生物毒力測(cè)試表明,ΔNr Pex16突變體菌株相比野生型菌株對(duì)斜紋夜的毒力顯著降低,其原因可能是由于突變體菌株生長(zhǎng)緩慢,代謝活性氧的能力下降,不能夠利用昆蟲(chóng)體內(nèi)脂肪酸作為碳源營(yíng)養(yǎng)所致。結(jié)論:建立了基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的萊氏野村菌split-marker遺傳轉(zhuǎn)化方法,該方法大大降低了無(wú)效轉(zhuǎn)化,敲除率達(dá)到80%以上。萊氏野村菌Nr Cat1和Nr Cat4基因同為過(guò)氧化氫酶超家族基因,單獨(dú)敲除一個(gè)基因會(huì)引起另外一個(gè)基因的代償表達(dá),這兩個(gè)基因的缺失會(huì)影響萊氏野村菌的抗逆性,毒力,孢子萌發(fā)和微菌核的形成;Nr Cat1的缺失還會(huì)影響萊斯野村菌的菌絲生長(zhǎng)以及產(chǎn)孢。Nr Pex16基因缺失會(huì)影響萊氏野村菌的菌絲生長(zhǎng),產(chǎn)孢,孢子萌發(fā),抗逆性,毒力和脂肪酸代謝。
【學(xué)位單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S476.12
【部分圖文】：

圖 1.1 過(guò)氧化物酶體生成假設(shè)模型（Bartoszewska et al., 2011）Fig. 1.1 Hypothetical model of peroxisome biogenesis. Peroxisomes can form de novo from theER. This step requires thefunction of a group of peroxisomal proteins, mainly Pex3, Pex16 andPex19. Peroxisomes can also proliferate by fission of existing organelles. In this process a yetunknown signal activates Pex11 proteins that lead to elongation of the organelle. The tubulatedorganelle attracts GTPases from the dynamin like family (DLPs) that assemble into highly orderedmultimers on the elongated organelle, causing actual membrane fission. The assembly of the DLPscomplex requires Fis1 and Mdv1. Next, the newly formedorganelle imports matrix and membrane proteins.細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體的數(shù)量由生成和降解過(guò)程嚴(yán)格調(diào)節(jié)，以保持細(xì)胞內(nèi)健康和新生過(guò)氧化物酶體的數(shù)量以防止細(xì)胞受損（Aksametal.2007）(圖 1.2)。 在酵母中，抑制細(xì)胞器降解會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生理缺陷，而且有可能會(huì)導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡（Aksametal.2007）。過(guò)氧化物酶體生成和選擇性降解之間緊密的互作可以使細(xì)胞快速的適應(yīng)環(huán)境條件的改變。

圖 1.1 過(guò)氧化物酶體生成假設(shè)模型（Bartoszewska et al., 201othetical model of peroxisome biogenesis. Peroxisomes can form requires thefunction of a group of peroxisomal proteins, mainly isomes can also proliferate by fission of existing organelles. In tnal activates Pex11 proteins that lead to elongation of the organelts GTPases from the dynamin like family (DLPs) that assemble ie elongated organelle, causing actual membrane fission. The asscomplex requires Fis1 and Mdv1. Next, the newly formedorganelle imports matrix and membrane proteins.氧化物酶體的數(shù)量由生成和降解過(guò)程嚴(yán)格調(diào)節(jié)，以物酶體的數(shù)量以防止細(xì)胞受損（Aksametal.2007）(圖器降解會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生理缺陷，而且有可能會(huì)導(dǎo)致.2007）。過(guò)氧化物酶體生成和選擇性降解之間緊密的境條件的改變。

1 緒 論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Karnik and Trelease, 2007）。從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到過(guò)氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)依賴(lài)兩組重疊分子目標(biāo)信號(hào)：第一組負(fù)責(zé)引導(dǎo)從細(xì)胞質(zhì)中的合成位點(diǎn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上；第二組引導(dǎo)其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到過(guò)氧化物酶體（Karnik and Trelease, 2007）。AtPEX16 的精確信號(hào)特性還是一個(gè)待解決的問(wèn)題，AtPEX16 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到過(guò)氧化物酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)似乎包含有一個(gè)所謂的“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-過(guò)氧化物酶體-中間物-隔間”（ERPIC），ERPIC 被設(shè)定為包含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所衍生的前過(guò)氧化物酶體，并且與成熟的過(guò)氧化物酶體悠閑融合（Karnik and Trelease, 2007）。類(lèi)ERPIC 隔室已經(jīng)在某些酵母和哺乳動(dòng)物中觀察到（TitorenkoandMullen,2006），但在植物中還未觀察到。PEX16 是過(guò)氧化物酶體生成的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)器，因生物體不同其功能和作用方式也顯著的不同，包括控制過(guò)氧化物酶體分裂生殖（例如，耶羅維亞酵母Pex16p（Guoetal.,2003,2007）），或過(guò)氧化物酶體的重頭合成（例如，人類(lèi) PEX16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2826069