浮游植物的生命活動(dòng)所消耗的能量源自太陽(yáng)光能,光合作用是浮游植物固定光能的最主要形式。近年來(lái),在包括浮游植物和細(xì)菌在內(nèi)的海洋微型生物中發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)被認(rèn)為是光能捕獲蛋白,該蛋白通過(guò)捕獲光能并能在細(xì)胞膜內(nèi)外形成離子梯度進(jìn)而合成ATP,即無(wú)需通過(guò)光合系統(tǒng)I和光合系統(tǒng)II也可將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,被認(rèn)為是能夠獨(dú)立于光合系統(tǒng)之外的能量轉(zhuǎn)化蛋白。視紫紅質(zhì)分布于許多微生物門(mén)類(lèi)中,包括古菌、細(xì)菌、真菌和藻類(lèi),是一種光驅(qū)動(dòng)型跨膜蛋白。根據(jù)其功能的不同,視紫紅質(zhì)可以劃分為質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)和離子泵型視紫紅質(zhì),陽(yáng)離子通道以及光感受器。根據(jù)基因序列比對(duì)甲藻中亦發(fā)現(xiàn)存在視紫紅質(zhì)基因,且根據(jù)氨基酸序列比對(duì)很可能屬于光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)�，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)東海原甲藻Prorocentrum dongaiense的視紫紅質(zhì)的表達(dá)有很強(qiáng)的晝夜周期節(jié)律性,光周期表達(dá)水平較高,暗周期表達(dá)水平較低。異養(yǎng)型甲藻海洋尖尾藻Oxyrrhis marina饑餓處理時(shí)質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)在有光照條件下的表達(dá)量高于黑暗條件,與其種群生長(zhǎng)率相對(duì)應(yīng),初步證實(shí)這個(gè)蛋白可作為能量補(bǔ)充機(jī)制。但對(duì)甲藻視紫紅質(zhì)更為深入的研究尚待開(kāi)展,至今還沒(méi)有直接證據(jù)表明甲藻中的視紫紅質(zhì)蛋白的具體功能與作用機(jī)制,和其在細(xì)胞中的具體表達(dá)位置。本研究以課題組已知序列的東海原甲藻以及鏈狀亞歷山大藻Alexandrium catenella(原種名:Alexandrium fundyense)的視紫紅質(zhì)基因?yàn)槟繕?biāo)基因,構(gòu)建了能夠表達(dá)這兩種甲藻視紫紅質(zhì)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),并在此系統(tǒng)中對(duì)東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻視紫紅質(zhì)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。主要研究結(jié)果如下:(1)論文將東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻視紫紅質(zhì)基因重組至表達(dá)載體PB513B-1,構(gòu)建了東海原甲藻視紫紅質(zhì)表達(dá)載體PB513B-PdRhod和鏈狀亞歷山大藻視紫紅質(zhì)表達(dá)載體PB513B-AcRhod。利用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)將PB513B-PdRhod與PB513B-AcRhod分別和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體PB200-PA共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入人的胚胎腎上皮細(xì)胞HEK293T細(xì)胞,借助Piggy Bac轉(zhuǎn)座系統(tǒng),構(gòu)建了可以表達(dá)甲藻基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。(2)論文在成功構(gòu)建表達(dá)甲藻基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的兩種甲藻視紫紅質(zhì)基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示東海原甲藻視紫紅質(zhì)蛋白以及鏈狀亞歷山大藻視紫紅質(zhì)蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)中均在細(xì)胞膜上表達(dá)。
【學(xué)位單位】：廈門(mén)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：Q78
【部分圖文】：

而質(zhì)子在類(lèi)囊體膜內(nèi)外兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子梯度，從而推動(dòng)光合磷酸化作用使得逡逑ＡＴＰ合成酶合成ＡＴＰ，二是在光的作用下，光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)能夠在膜內(nèi)逡逑外兩側(cè)產(chǎn)生質(zhì)子梯度從而驅(qū)動(dòng)ＡＴＰ合成酶合成ＡＴＰ（如圖１．１）。光驅(qū)動(dòng)型視紫紅逡逑質(zhì)可直接將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，即ＡＴＰ，這打破了以往人們對(duì)于光能只能通過(guò)基逡逑于葉綠素的光合作用才能進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ等［１７］也認(rèn)為微生逡逑物視紫紅質(zhì)蛋白在海洋浮游群落結(jié)構(gòu)以及海洋碳循環(huán)過(guò)程中有著重要的意義。逡逑Ｇｕｏ等［２３］對(duì)海洋尖尾藻利用轉(zhuǎn)錄組及定量ＰＣＲ等手段研究質(zhì)子泵型的視紫紅逡逑質(zhì)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在饑餓條件下，給予海洋尖尾藻光照時(shí)，視紫紅質(zhì)基因的表達(dá)逡逑量和細(xì)胞的生長(zhǎng)率均高于連續(xù)黑暗中培養(yǎng)的海洋尖尾藻。由于海洋尖尾藻為異養(yǎng)逡逑型藻，不投喂食物時(shí)，視紫紅質(zhì)在光照條件下所固定的能量極有可能是海洋尖尾逡逑藻生命活動(dòng)所需能量的主要來(lái)源。這與光驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)能夠在光照條件逡逑下提高饑餓處理的細(xì)菌成活率的結(jié)果一致［２４］。Ｓｈｉ等［２０］經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)東海原甲藻逡逑的視紫紅質(zhì)的表達(dá)有很強(qiáng)的晝夜周期節(jié)律性，光周期表達(dá)水平較高，暗周期表達(dá)逡逑水平較低，同時(shí)，東海原甲藻視紫紅質(zhì)在中等光強(qiáng)下（１００邋ｕＥ／ｍ％１）表達(dá)水平逡逑最高，這與赤潮時(shí)海水較混濁，光穿透性不強(qiáng)的生態(tài)現(xiàn)象一致，由此猜測(cè)視紫紅逡逑質(zhì)可能是赤潮發(fā)生時(shí)東海原甲藻獲得能量的重要來(lái)源。所以研究甲藻視紫紅質(zhì)蛋逡逑白在甲藻中的表達(dá)特性有助于了觶甲藻視紫紅質(zhì)蛋白在海洋生態(tài)系統(tǒng)中為光能逡逑固定所做的貢獻(xiàn)以及其在海洋環(huán)境中的重要作用。逡逑微生物質(zhì)子泵型視紫紅質(zhì)的功能研宄主要集中在對(duì)海洋細(xì)菌視紫紅質(zhì)的研逡逑[

本文編號(hào)：2826604