發(fā)布時(shí)間：2020-09-22 16:26

　　 近年來土壤鹽堿化程度的不斷增加對植物生長、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及糧食供應(yīng)等方面造成嚴(yán)重的影響。土壤中鹽與堿往往是相伴而生的,鹽脅迫一般會給植物造成滲透脅迫與離子損傷,而堿脅迫除了導(dǎo)致上述脅迫外,還會嚴(yán)重影響土壤的pH,阻礙植物對離子的正常吸收并擾亂細(xì)胞內(nèi)離子平衡,使細(xì)胞膜、植物根系與光合系統(tǒng)等受損,對植物的正常生長造成極大傷害。所以人們需要對鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制與堿脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行深入研究,從而解決鹽、堿脅迫對植物造成的損傷。實(shí)驗(yàn)室前期利用普通小麥濟(jì)南177(JN177)和長穗偃麥草通過不對稱體細(xì)胞雜交的技術(shù),獲得了一系列小麥漸滲系,并從中選育了耐鹽的小麥漸滲系新品種—山融3號(SR3)與耐鹽堿的小麥漸滲系新品系—山融4號(SR4)。田間種植與實(shí)驗(yàn)鑒定表明SR3與SR4具有很強(qiáng)的耐鹽堿能力,其中SR3耐鹽性更強(qiáng),而SR4耐堿性突出。利用第二代高通量測序技術(shù)對SR3鹽處理與SR4堿處理后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,挑選出一個(gè)在SR3根中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)變化較大的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子TaWRKY46基因,一個(gè)在SR4根中受堿脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaNRT1.2基因,進(jìn)一步研究它們在鹽堿脅迫中的功能及作用機(jī)制。1.小麥鹽脅迫應(yīng)答基因TaWRKY46的功能探究我們從SR3中克隆到一個(gè)約669 bp的TaWRKY46開放閱讀框。對其保守結(jié)構(gòu)域分析后發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子,在多種非生物脅迫處理下呈現(xiàn)了不同的表達(dá)模式。TaWRK46主要定位于細(xì)胞核,在酵母系統(tǒng)中驗(yàn)證了其具有體外轉(zhuǎn)錄激活活性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將TaWRKY46轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0),獲得了兩個(gè)TaWRKY46異源過量表達(dá)的純合株系(OE)。在正常生長條件下,TaWRKY46 OE系的生長與野生型植株無明顯差異,但是在鹽脅迫條件下,TaWRKY46OE系的葉片面積明顯小于野生型擬南芥,表現(xiàn)出對鹽脅迫的敏感性;氧化脅迫條件下,TaWRKY46OE系的葉片面積顯著大于對照,表現(xiàn)了對氧化脅迫的顯著抗性。DAB和NBT染色結(jié)果顯示TaWRKY46 OE系積累的ROS含量明顯低于野生型,ROS清除酶活性也有顯著提升,檢測過表達(dá)系與野生型的ROS信號通路中的marker gene發(fā)現(xiàn)ROS清除相關(guān)的基因CAT2、FeSOD1 FeSOD3、CuZnSOD3表達(dá)上調(diào),ROS合成相關(guān)的基因rbohC、rbohD、rbohE的表達(dá)下調(diào),因此我們推測ROS信號通路在TaWRKY46介導(dǎo)的鹽脅迫、氧化脅迫響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外,在施加外源ABA的條件下,OE系較野生型的生長總是被抑制的,表現(xiàn)出對ABA的敏感性。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示,TaWRKY46OE系A(chǔ)BA信號通路中的marker gene ABA1,ABA2,ABI5的表達(dá)量明顯高于野生型,我們推測,ABA信號通路可能在TaWRKY46介導(dǎo)的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。2.小麥堿脅迫應(yīng)答基因TaNRT1.2功能探究我們從SR4中克隆到一個(gè)約471 bp的開放閱讀框。它是一個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,非生物脅迫分析顯示TaNRT1.2參與到了小麥對多種脅迫環(huán)境的響應(yīng)。TaNRT1.2定位于細(xì)胞膜。將TaNRT1.2轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0),獲得了兩個(gè)擬南芥過表達(dá)的純合株系(OE)。在正常生長條件下,TaNRT1.2擬南芥OE系的生長發(fā)育相較于野生型擬南芥無明顯差異,在堿脅迫與氧化脅迫條件下,TaNRT1.2過表達(dá)系的葉片面積顯著小于對照,主根根長明顯短于對照,展現(xiàn)了對堿脅迫與氧化脅迫的顯著敏感性。DAB和NBT染色結(jié)果顯示TaNRT1.2 OE系的ROS含量明顯高于野生型,且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,ROS合成相關(guān)的基因rbohC,rbohD,rbohE,brohF和rbohG表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào),ROS清除相關(guān)的Cu/ZnSOD2,CAT2,GPX2基因的表達(dá)發(fā)生下調(diào)。此外,在施加外源ABA的條件下,OE系較野生型的生長總是被促進(jìn)的,表現(xiàn)出對ABA的不敏感性,對ABA信號通路中的marker gene分析發(fā)現(xiàn)ABI1,ABI2,ABI5的表達(dá)上調(diào)。我們推測,ROS信號通路與ABA信號通路可能在TaNRT1.2介導(dǎo)的堿脅迫響應(yīng)的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋Ｓｔｕｄｅｎｔ�。箦澹簦簦澹螅�，邋ａｔ邋＊Ｐ＜０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在２００邋ｍＭ邋ＮａＣＩ處理下，親本ＪＮ１７７與ＳＲ３的葉片中，逡逑Ｔｏ灰／漢７￥６在０－４８ｈ內(nèi)的表達(dá)變化均不是很明顯（圖３－１Ａ）；但是在ＪＮ１７７的逡逑根中的表達(dá)量在處理后的４８ｈ內(nèi)發(fā)生了明顯地下調(diào)，下調(diào)大約１０逡逑倍（圖３－１Ｂ）；而在ＳＲ３的根中，２００ｍＭＮａＣｌ處理后的０－６ｈ內(nèi)化＃兄０４５逡逑的表達(dá)量沒有發(fā)生明顯變化，但是在１２－４８邋ｈ期間，表達(dá)量發(fā)生了明顯地上調(diào)，逡逑在１２邋ｈ時(shí)上調(diào)的倍數(shù)達(dá)到最大，大約為１２倍（圖３－］邋Ｂ）。逡逑在１００ｍＭ堿處理下，％奶漢７必在ＪＮ１７７與ＳＲ３的葉中表達(dá)顯著下調(diào)（圖逡逑３－２Ｃ）；在ＪＮ１７７根中０．５ｈ－２４ｈ內(nèi)處于上調(diào)表達(dá)，但是４８ｈ后表達(dá)發(fā)生了明逡逑顯下調(diào)；而在ＳＲ３根中表達(dá)一直上調(diào)且在２４邋ｈ時(shí)上調(diào)了大約５倍（圖３－２邋Ｄ）。逡逑在ｌＯＯ＾ＭＡＢＡ處理后

該基因構(gòu)建到ＰＧＢＫＴ７載體上，轉(zhuǎn)化酵母菌株ＡＨ１０９，并在Ｔｒｐ／Ｈｉｓ的二缺培逡逑養(yǎng)基上培養(yǎng)。逡逑如圖３－４所示，轉(zhuǎn)化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７或ｐＧＢＫＴ７空載質(zhì)粒的酵母可逡逑以在Ｔｒｐ單培養(yǎng)基上生長，但只有轉(zhuǎn)化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７的酵母可以在逡逑Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培養(yǎng)基上正常生長。這一結(jié)果是由于ＴａＷＲＫＹ４６激活結(jié)構(gòu)域與逡逑ＰＧＢＫＴ７載體上的ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域共同作用，激活了下游基因的表達(dá)，從而賦逡逑予酵母在缺Ｈｉｓ的培養(yǎng)基上生長的能力。以上證據(jù)表明：ＴａＷＲＫＹ４６具有體外逡逑轉(zhuǎn)錄激活活性。逡逑１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌＱＱＱｘ邐１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌ000ｘ逡逑ＴａＷＲＫＹ４６－邋ｆ逡逑ｐＧＢＫＴ７－２逡逑Ｔｒｐ單缺培養(yǎng)基邐Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培養(yǎng)基逡逑圖３－４邋ＴａＷＲＫＹ４６體外轉(zhuǎn)錄激活活性的檢測逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＴａＷＲＫＹ４６邋ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑３．５邐轉(zhuǎn)基因擬南芥純系的篩選逡逑在各種非生物脅迫下小麥ＳＲ３中７＾股尤７￥６表達(dá)發(fā)生了明顯的變化，因此逡逑為了進(jìn)一步研究該基因在植物響應(yīng)各種非生物脅迫中的作用，把從ＳＲ３克隆的逡逑必的ＯＲＦ通過酶切連接法構(gòu)建到ｐＲＩ１０１－ＡＮ載體上，該載體可以使目逡逑的基因在雙子葉植物中高效而且穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)過篩選得到Ｔ３代的純系過表達(dá)植逡逑株，提取野生型與過表達(dá)系的ＲＮＡ，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到ｃＤＮＡ，利用ｑＲＴ－ＰＣＲ檢逡逑測該基因在過表達(dá)系中的表達(dá)量，挑取兩個(gè)表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系（ＯＥ１，逡逑ＯＥ２）用于后續(xù)功能研究（圖３－５）。逡逑２３逡逑

邐山東大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑外源ＡＢＡ的響應(yīng)過程，我們對過表達(dá)株系在對照與不同濃度ＡＢＡ脅迫處理下逡逑的生長狀況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)對照條件下的野生型與過表達(dá)系生長一致，在４邋ｐＭ、逡逑５邋ｐＭ、６邋＾ＭＡＢＡ處理下過表達(dá)系的葉片面積沒有差異，但是主根長度明顯比逡逑野生型短。從以上結(jié)果推測７＾＾１７４６導(dǎo)致了擬南芥對ＡＢＡ敏感（圖３－７），逡逑可能在調(diào)控植物對ＡＢＡ脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮作用。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;The alkaline tolerance in Arabidopsis requires stabilizing microfilament partially through inactivation of PKS5 kinase[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年07期

2 江文波;余迪求;;擬南芥WRKY2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可能參與調(diào)控滲透脅迫反應(yīng)[J];云南植物研究;2009年05期

3 石德成;殷立娟;;鹽(NaCl)與堿(Na_2CO_3)對星星草脅迫作用的差異[J];Journal of Integrative Plant Biology;1993年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 孟晨;小麥漸滲系山融4號根系堿脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組及相關(guān)基因功能研究[D];山東大學(xué);2015年

本文編號：2824638