背景與目的甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)是影響人類的最具侵襲性的實體瘤之一,診斷后中位生存期為3至5個月。1年和10年生存率分別預估為10-20%和小于5%。雖然也有文獻發(fā)表有長期幸存的患者,但這種案例的診斷可靠性常常受到質(zhì)疑。盡管甲狀腺未分化癌僅占全部甲狀腺惡性腫瘤的1-3%,但每年高達14-50%的甲狀腺癌相關死亡與其相關。ATC治療方法有限,通常對標準的放療及化學治療不敏感,因此了解ATC腫瘤的能量代謝和分子發(fā)病機制可能為該疾病的治療提供新的希望。我們知道癌癥細胞和非癌細胞在其生長代謝的過程中有很大的差別,許多癌細胞的代謝方式會被基因重新編程。正常細胞在組織內(nèi)氧氣充分的情況下,主要通過在線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)的方式代謝葡萄糖產(chǎn)生能量,一般在缺氧的情況下,才會通過糖酵解代謝的方式,將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸,快速供能。一旦氧氣充足后,乳酸會逆向轉(zhuǎn)換成丙酮酸,重新進入線粒體內(nèi),氧化還原,最終生成二氧化碳、水和ATP。但是癌癥細胞即使在氧氣充足的情況下,也會利用糖酵解,而不是線粒體氧化磷酸化的方式來代謝葡萄糖供能。這種現(xiàn)象被稱之為Warburg效應。乳酸脫氫酶(LDH)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的細胞糖酵解代謝途徑中的關鍵酶。其在癌細胞中的表達對腫瘤細胞生長代謝的維持、以及腫瘤惡性表型的發(fā)生、進展都有影響。LDH是由不同位置的基因編碼的兩個不同的亞單位(LDHa和LDHb)組成的四聚體。LDH可催化丙酮酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)與乳酸和NAD+的相互轉(zhuǎn)化。催化方向多取決于LDH復合物中兩種不同的亞單位LDHa和LDHb所構成的酶的比例,一般認為LDHa促進丙酮酸還原成乳酸鹽伴隨著NADH脫氫轉(zhuǎn)化為NAD+,而LDHb則有利于向相反的方向催化。本課題我們以癌細胞的較為獨特的能量代謝方式,即糖酵解代謝為研究切入點,首先通過oncomine數(shù)據(jù)庫分析確定LDH基因在不同病理類型的甲狀腺癌中表達有差異。隨后通過構建經(jīng)多西環(huán)素(Doxycycline,DOX)控制表達的重組慢病毒載體Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb,感染甲狀腺未分化癌Hth83細胞系,建立穩(wěn)定的基因沉默可控的細胞系。然后對該慢病毒感染的細胞行單克隆篩選,找到LDHa、LDHb基因表達可被持續(xù)、穩(wěn)定沉默的單克隆細胞系。研究shLDHa、shLDHb基因的表達,對ATC細胞系腫瘤表型的影響及其對乳酸脫氫酶活性和下游產(chǎn)物乳酸產(chǎn)生的影響;進一步我們還建立了裸鼠的甲狀腺區(qū)原位移植瘤模型,觀察誘導下調(diào)LDHa基因的ATC細胞系在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;驗證在裸鼠體內(nèi)抑制LDHa基因?qū)δ[瘤乳酸脫氫酶蛋白的生成及酶活性的影響。本課題的研究不僅有助于闡明腫瘤代謝途徑中關鍵酶LDH在ATC中的生物學功能和對腫瘤生長代謝的影響,還可能為ATC的治療提供新的思路和干預靶點。第一章:重組慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC細胞系Hth83中的制備及生物功能的研究第一部分:重組慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC細胞系Hth83中的制備、鑒定及單克隆篩選方法1.擴增可誘導表達基因沉默的線性化載體p Inducer-EmGFP-mirRNA。2.設計LDHa、LDHb基因的干擾片段,制備線性化干擾載體,經(jīng)退火、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定,構建LDH基因干擾慢病毒載體Lenti-shLDHb、Lenti-shLDHa。3.慢病毒進行包裝、純化、濃縮,利用梯度稀釋法測定病毒滴度,用感染復數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)=10、25、50、75、100、200、500對Hth83細胞感染后,通過熒光觀察測定綠色熒光細胞占細胞總數(shù)的比例。4.重組慢病毒Lenti-LDHa和Lenti-shLDHb感染成功后,分別觀察細胞形態(tài)學變化,MTT實驗檢測細胞增殖能力,Western-blot檢測蛋白的表達情況。5.Hth83-shLDHa細胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合細胞懸液,送流式細胞儀分選單細胞株種植于96孔板內(nèi),培養(yǎng)10-14天取單克隆增殖株消化擴增,Western-blot檢測蛋白表達。篩選出經(jīng)DOX誘導表達后,LDHa被高效抑制的單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31。6.Hth83-shLDHb細胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合細胞懸液,送流式細胞儀分選單細胞株種植于96孔板內(nèi),培養(yǎng)10-14天取單克隆增殖株消化擴增,Western-blot檢測蛋白表達。篩選出經(jīng)DOX誘導表達后,LDHb被高效抑制的單克隆細胞系Hth83-shLDHb-6,Hth83-shLDHa-18。結(jié)果1.在原有Hth83細胞系成功轉(zhuǎn)染Luciferase蛋白的基礎上,成功構建了慢病毒感染的LDH抑制表達可控的細胞系Hth83-shLDHa、Hth83-shLDHb,綠色熒光顯示表達效率高達75%以上,可以滿足后續(xù)實驗要求。2.不同DOX濃度和時間下誘導抑制shLDHa、shLDHa基因表達后,Western-blot檢測顯示LDHa、LDHb蛋白表達均可得到明顯的抑制。高濃度DOX誘導抑制后顯微鏡下觀察Hth83細胞生長受抑,細胞分散,可見細胞碎片,細胞攣縮。3.不同DOX濃度、時間誘導抑制LDH基因后,MTT檢測顯示者在10μg/mL DOX濃度處理組,細胞增殖能力的下降具有顯著的統(tǒng)計學差異。4.分別成功篩選出單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18,在不同DOX濃度及不同作用時間的誘導下Western-blot驗證LDHa、LDHb蛋白均能被高效抑制,從而找到最佳抑制劑量及最佳作用時間,為下一步的細胞功能實驗打基礎。第二部分:單克隆Hth83細胞系中抑制LDH表達對細胞功能、酶活性及乳酸的影響方法1.乳酸檢測試劑盒檢測單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導shLDHa、shLDHb基因的表達后,細胞內(nèi)乳酸生成的變化。2.利用乳酸脫氫酶試劑盒檢測單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導shLDHa、shLDHb基因的表達,細胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活性。3.以MTT法檢測單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導shLDHa、shLDHb基因的表達,對細胞增殖能力的影響。4.平板實驗法檢測單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導shLDHa、shLDHb基因的表達,對細胞單克隆形成能力的影響。5.劃痕實驗法檢測單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31經(jīng)DOX誘導shLDHa基因的表達,對細胞遷徙能力的影響。6.利用流式細胞儀檢測單克隆細胞系細胞Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31經(jīng)DOX誘導shLDHa基因的表達,檢測凋亡細胞數(shù)改變。結(jié)果1.以加入DOX后誘導shLDHa、shLDHb表達的為實驗組,不加DOX的為對照組。當DOX作用Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細胞24小時后,實驗組較對照組乳酸含量下降(p0.05);但作用96小時后乳酸含量實驗組較對照組無明顯差異;且不同濃度的DOX誘導對腫瘤乳酸的產(chǎn)生無明顯差異(p0.05)。DOX作用Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細胞24小時后,高濃度DOX誘導組乳酸的產(chǎn)生均出現(xiàn)輕度降低;但在Hth83-shLDHb-18細胞低濃度實驗組乳酸含量與對照比較無明顯差異(p0.05)。作用96小時后乳酸的產(chǎn)生在Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細胞高、低濃度DOX實驗組較對照組均無差異(p0.05)。2.實驗組加入DOX沉默Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細胞LDHa表達后,乳酸脫氫酶活性較對照組均明顯降低(p0.05)。且高濃度DOX誘導組較低濃度組,乳酸脫氫酶活性降低更明顯;隨著作用時間延長到96小時,乳酸脫氫酶活性進一步減低(p0.05)。Hth83-shLDHb-18細胞DOX作用24小時后乳酸脫氫酶活性較對照組輕度降低(p0.05);但Hth83-shLDHb-6實驗組較對照組,乳酸脫氫酶活性無差異(p0.05)。96小時組Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18實驗組較對照組乳酸脫氫酶活性無明顯差異(p0.05)。3.Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細胞實驗組以DOX誘導24小時后,較對照組細胞活性無明顯差異;DOX誘導48、72、96小時后實驗組較對照組細胞活性明顯降低,且隨著DOX抑制濃度的增加,細胞活性明顯降低(p0.05)。Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細胞系DOX誘導24、48、72小時后,實驗組較對照組細胞活性無明顯差異;DOX誘導96小時后實驗組較對照組細胞活性降低(p0.05)。4.抑制LDHa、LDHb基因的表達,單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18均出現(xiàn)顯著的細胞克隆形成抑制(p0.01),且相較于對照組隨著實驗組DOX濃度的增加,克隆形成能力也隨之減弱。5.DOX誘導shLDHa抑制LDHa的表達后,單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31,實驗組和對照組間腫瘤細胞的遷移距離無統(tǒng)計學差異(p0.05)。6.實驗組以不同濃度的DOX抑制LDHa的表達后,單克隆細胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31未出現(xiàn)明顯的凋亡峰,且相較于對照組細胞周期數(shù)無明顯差別(p0.05)。第二章:抑制LDH對裸鼠移植瘤生長及代謝的研究方法1.于裸鼠甲狀腺內(nèi)原位種植Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細胞系,建立人移植瘤動物模型。2.注射后第5天開始,分別給予含有和不含有DOX的飲食,誘導shLDHa基因的表達,每兩至三天應用影像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤體積變化和瘤重。3.實驗組及對照組分別給予含或不含DOX的飲食,待移植瘤模型建立穩(wěn)定后,每組分別取出3只裸鼠的移植瘤組織,用蛋白印跡實驗檢查移植瘤組織內(nèi)LDHa表達。4.實驗組及對照組分別給予含或不含DOX的飲食,待移植瘤模型建立穩(wěn)定后,每組分別取出3只裸鼠的移植瘤組織,用乳酸脫氫酶檢測試劑盒檢測組織內(nèi)LDH的活性。5.監(jiān)測人腫瘤移植模型裸鼠的總生存期,繪制生存曲線。結(jié)果1.成功建立了LDHa基因表達下調(diào)的ATC原位裸鼠移植瘤模型。2.實驗組裸鼠腫瘤生長慢于對照組,接種1周后小動物活體熒光成像系統(tǒng)顯示實驗組熒光強度顯著低于對照組(P=0.003)。且實驗組裸鼠剝除的瘤體體積及重量小于對照組(P=0.0031和P=0.002)。3.LDHa蛋白表達量在實驗組腫瘤組織中的表達低于對照組(P=0.286)。4.乳酸脫氫酶活性在實驗組腫瘤組織中的表達低于對照組(P=0.231)。5.實驗組人腫瘤移植模型裸鼠的總生存期長于對照組裸鼠的總生存期。結(jié)論1.oncomine數(shù)據(jù)庫中提示LDHa在甲狀腺未分化癌中高表達,提示LDH在甲狀腺未分化癌中有良好的研究前景。2.抑制LDHa基因能夠有效抑制Hth83細胞的增殖及腫瘤克隆的形成,但對細胞的遷徙能力及細胞周期無顯著影響。3.LDHa或LDHb表達的抑制,均能夠有效的降低Hth83細胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活性,并暫時性的降低了乳酸的濃度。4.慢病毒轉(zhuǎn)染的方法沉默LDHa、LDHb,對Hth83細胞系乳酸脫氫酶、乳酸的產(chǎn)生均有抑制作用;但沉默LDHa的效果要好于沉默LDHb。5.裸鼠體內(nèi)表達shLDHa可抑制LDHa蛋白的生成和酶的活性。6.裸鼠體內(nèi)抑制LDHa,可顯著抑制人甲狀腺癌移植瘤的生長,延長了異種移植瘤裸鼠的生存期。提示LDHa有可能作為ATC患者的潛在治療靶點。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R736.1
【部分圖文】：

結(jié) 果重組慢病毒 Lenti-shLDHa 及 Lenti-shLDHb 的制備、鑒定 oncomine 數(shù)據(jù)庫檢測 LDH 基因在甲狀腺癌中的表達圖 1 中我們看出，不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa、LDHb 表達有差異，在甲狀腺未分化癌中，LDHa 表達水平較高。

oncomine 數(shù)據(jù)庫檢測 LDH 基因在甲狀腺癌中的表達圖 1 中我們看出，不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa、LDHb 表達有差異甲狀腺未分化癌中，LDHa 表達水平較高。圖 1A 不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa 的表達

慢病毒的包裝、制備、滴度測定和對 Hth-83 細胞感染效率的慢病毒載體構建乳酸脫氫酶可調(diào)節(jié)表達的短發(fā)夾干擾 Hth83-hLDHb 細胞系。配制磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系，該體系與 293T 細胞共后觀察熒光情況，48 小時后再次觀察熒光情況，并收集病毒上的方法來測定病毒的滴度。測定結(jié)果顯示濃縮后的四種病毒FU/mL。通過對 Hth83 細胞的感染效率測定發(fā)現(xiàn)，當 MOI=80胞的效率可達 75%以上，可以滿足進一步的實驗需求，見圖

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