背景與目的甲狀腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)是影響人類的最具侵襲性的實體瘤之一,診斷后中位生存期為3至5個月。1年和10年生存率分別預(yù)估為10-20%和小于5%。雖然也有文獻(xiàn)發(fā)表有長期幸存的患者,但這種案例的診斷可靠性常常受到質(zhì)疑。盡管甲狀腺未分化癌僅占全部甲狀腺惡性腫瘤的1-3%,但每年高達(dá)14-50%的甲狀腺癌相關(guān)死亡與其相關(guān)。ATC治療方法有限,通常對標(biāo)準(zhǔn)的放療及化學(xué)治療不敏感,因此了解ATC腫瘤的能量代謝和分子發(fā)病機(jī)制可能為該疾病的治療提供新的希望。我們知道癌癥細(xì)胞和非癌細(xì)胞在其生長代謝的過程中有很大的差別,許多癌細(xì)胞的代謝方式會被基因重新編程。正常細(xì)胞在組織內(nèi)氧氣充分的情況下,主要通過在線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)的方式代謝葡萄糖產(chǎn)生能量,一般在缺氧的情況下,才會通過糖酵解代謝的方式,將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸,快速供能。一旦氧氣充足后,乳酸會逆向轉(zhuǎn)換成丙酮酸,重新進(jìn)入線粒體內(nèi),氧化還原,最終生成二氧化碳、水和ATP。但是癌癥細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下,也會利用糖酵解,而不是線粒體氧化磷酸化的方式來代謝葡萄糖供能。這種現(xiàn)象被稱之為Warburg效應(yīng)。乳酸脫氫酶(LDH)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的細(xì)胞糖酵解代謝途徑中的關(guān)鍵酶。其在癌細(xì)胞中的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生長代謝的維持、以及腫瘤惡性表型的發(fā)生、進(jìn)展都有影響。LDH是由不同位置的基因編碼的兩個不同的亞單位(LDHa和LDHb)組成的四聚體。LDH可催化丙酮酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)與乳酸和NAD+的相互轉(zhuǎn)化。催化方向多取決于LDH復(fù)合物中兩種不同的亞單位LDHa和LDHb所構(gòu)成的酶的比例,一般認(rèn)為LDHa促進(jìn)丙酮酸還原成乳酸鹽伴隨著NADH脫氫轉(zhuǎn)化為NAD+,而LDHb則有利于向相反的方向催化。本課題我們以癌細(xì)胞的較為獨(dú)特的能量代謝方式,即糖酵解代謝為研究切入點(diǎn),首先通過oncomine數(shù)據(jù)庫分析確定LDH基因在不同病理類型的甲狀腺癌中表達(dá)有差異。隨后通過構(gòu)建經(jīng)多西環(huán)素(Doxycycline,DOX)控制表達(dá)的重組慢病毒載體Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb,感染甲狀腺未分化癌Hth83細(xì)胞系,建立穩(wěn)定的基因沉默可控的細(xì)胞系。然后對該慢病毒感染的細(xì)胞行單克隆篩選,找到LDHa、LDHb基因表達(dá)可被持續(xù)、穩(wěn)定沉默的單克隆細(xì)胞系。研究shLDHa、shLDHb基因的表達(dá),對ATC細(xì)胞系腫瘤表型的影響及其對乳酸脫氫酶活性和下游產(chǎn)物乳酸產(chǎn)生的影響;進(jìn)一步我們還建立了裸鼠的甲狀腺區(qū)原位移植瘤模型,觀察誘導(dǎo)下調(diào)LDHa基因的ATC細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;驗證在裸鼠體內(nèi)抑制LDHa基因?qū)δ[瘤乳酸脫氫酶蛋白的生成及酶活性的影響。本課題的研究不僅有助于闡明腫瘤代謝途徑中關(guān)鍵酶LDH在ATC中的生物學(xué)功能和對腫瘤生長代謝的影響,還可能為ATC的治療提供新的思路和干預(yù)靶點(diǎn)。第一章:重組慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC細(xì)胞系Hth83中的制備及生物功能的研究第一部分:重組慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC細(xì)胞系Hth83中的制備、鑒定及單克隆篩選方法1.擴(kuò)增可誘導(dǎo)表達(dá)基因沉默的線性化載體p Inducer-EmGFP-mirRNA。2.設(shè)計LDHa、LDHb基因的干擾片段,制備線性化干擾載體,經(jīng)退火、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定,構(gòu)建LDH基因干擾慢病毒載體Lenti-shLDHb、Lenti-shLDHa。3.慢病毒進(jìn)行包裝、純化、濃縮,利用梯度稀釋法測定病毒滴度,用感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)=10、25、50、75、100、200、500對Hth83細(xì)胞感染后,通過熒光觀察測定綠色熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。4.重組慢病毒Lenti-LDHa和Lenti-shLDHb感染成功后,分別觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力,Western-blot檢測蛋白的表達(dá)情況。5.Hth83-shLDHa細(xì)胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合細(xì)胞懸液,送流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞株種植于96孔板內(nèi),培養(yǎng)10-14天取單克隆增殖株消化擴(kuò)增,Western-blot檢測蛋白表達(dá)。篩選出經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后,LDHa被高效抑制的單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31。6.Hth83-shLDHb細(xì)胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合細(xì)胞懸液,送流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞株種植于96孔板內(nèi),培養(yǎng)10-14天取單克隆增殖株消化擴(kuò)增,Western-blot檢測蛋白表達(dá)。篩選出經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后,LDHb被高效抑制的單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHb-6,Hth83-shLDHa-18。結(jié)果1.在原有Hth83細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染Luciferase蛋白的基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了慢病毒感染的LDH抑制表達(dá)可控的細(xì)胞系Hth83-shLDHa、Hth83-shLDHb,綠色熒光顯示表達(dá)效率高達(dá)75%以上,可以滿足后續(xù)實驗要求。2.不同DOX濃度和時間下誘導(dǎo)抑制shLDHa、shLDHa基因表達(dá)后,Western-blot檢測顯示LDHa、LDHb蛋白表達(dá)均可得到明顯的抑制。高濃度DOX誘導(dǎo)抑制后顯微鏡下觀察Hth83細(xì)胞生長受抑,細(xì)胞分散,可見細(xì)胞碎片,細(xì)胞攣縮。3.不同DOX濃度、時間誘導(dǎo)抑制LDH基因后,MTT檢測顯示者在10μg/mL DOX濃度處理組,細(xì)胞增殖能力的下降具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。4.分別成功篩選出單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18,在不同DOX濃度及不同作用時間的誘導(dǎo)下Western-blot驗證LDHa、LDHb蛋白均能被高效抑制,從而找到最佳抑制劑量及最佳作用時間,為下一步的細(xì)胞功能實驗打基礎(chǔ)。第二部分:單克隆Hth83細(xì)胞系中抑制LDH表達(dá)對細(xì)胞功能、酶活性及乳酸的影響方法1.乳酸檢測試劑盒檢測單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa、shLDHb基因的表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)乳酸生成的變化。2.利用乳酸脫氫酶試劑盒檢測單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa、shLDHb基因的表達(dá),細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活性。3.以MTT法檢測單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa、shLDHb基因的表達(dá),對細(xì)胞增殖能力的影響。4.平板實驗法檢測單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa、shLDHb基因的表達(dá),對細(xì)胞單克隆形成能力的影響。5.劃痕實驗法檢測單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa基因的表達(dá),對細(xì)胞遷徙能力的影響。6.利用流式細(xì)胞儀檢測單克隆細(xì)胞系細(xì)胞Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31經(jīng)DOX誘導(dǎo)shLDHa基因的表達(dá),檢測凋亡細(xì)胞數(shù)改變。結(jié)果1.以加入DOX后誘導(dǎo)shLDHa、shLDHb表達(dá)的為實驗組,不加DOX的為對照組。當(dāng)DOX作用Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細(xì)胞24小時后,實驗組較對照組乳酸含量下降(p0.05);但作用96小時后乳酸含量實驗組較對照組無明顯差異;且不同濃度的DOX誘導(dǎo)對腫瘤乳酸的產(chǎn)生無明顯差異(p0.05)。DOX作用Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細(xì)胞24小時后,高濃度DOX誘導(dǎo)組乳酸的產(chǎn)生均出現(xiàn)輕度降低;但在Hth83-shLDHb-18細(xì)胞低濃度實驗組乳酸含量與對照比較無明顯差異(p0.05)。作用96小時后乳酸的產(chǎn)生在Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細(xì)胞高、低濃度DOX實驗組較對照組均無差異(p0.05)。2.實驗組加入DOX沉默Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細(xì)胞LDHa表達(dá)后,乳酸脫氫酶活性較對照組均明顯降低(p0.05)。且高濃度DOX誘導(dǎo)組較低濃度組,乳酸脫氫酶活性降低更明顯;隨著作用時間延長到96小時,乳酸脫氫酶活性進(jìn)一步減低(p0.05)。Hth83-shLDHb-18細(xì)胞DOX作用24小時后乳酸脫氫酶活性較對照組輕度降低(p0.05);但Hth83-shLDHb-6實驗組較對照組,乳酸脫氫酶活性無差異(p0.05)。96小時組Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18實驗組較對照組乳酸脫氫酶活性無明顯差異(p0.05)。3.Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細(xì)胞實驗組以DOX誘導(dǎo)24小時后,較對照組細(xì)胞活性無明顯差異;DOX誘導(dǎo)48、72、96小時后實驗組較對照組細(xì)胞活性明顯降低,且隨著DOX抑制濃度的增加,細(xì)胞活性明顯降低(p0.05)。Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18細(xì)胞系DOX誘導(dǎo)24、48、72小時后,實驗組較對照組細(xì)胞活性無明顯差異;DOX誘導(dǎo)96小時后實驗組較對照組細(xì)胞活性降低(p0.05)。4.抑制LDHa、LDHb基因的表達(dá),單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18均出現(xiàn)顯著的細(xì)胞克隆形成抑制(p0.01),且相較于對照組隨著實驗組DOX濃度的增加,克隆形成能力也隨之減弱。5.DOX誘導(dǎo)shLDHa抑制LDHa的表達(dá)后,單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31,實驗組和對照組間腫瘤細(xì)胞的遷移距離無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。6.實驗組以不同濃度的DOX抑制LDHa的表達(dá)后,單克隆細(xì)胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31未出現(xiàn)明顯的凋亡峰,且相較于對照組細(xì)胞周期數(shù)無明顯差別(p0.05)。第二章:抑制LDH對裸鼠移植瘤生長及代謝的研究方法1.于裸鼠甲狀腺內(nèi)原位種植Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31細(xì)胞系,建立人移植瘤動物模型。2.注射后第5天開始,分別給予含有和不含有DOX的飲食,誘導(dǎo)shLDHa基因的表達(dá),每兩至三天應(yīng)用影像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測腫瘤體積變化和瘤重。3.實驗組及對照組分別給予含或不含DOX的飲食,待移植瘤模型建立穩(wěn)定后,每組分別取出3只裸鼠的移植瘤組織,用蛋白印跡實驗檢查移植瘤組織內(nèi)LDHa表達(dá)。4.實驗組及對照組分別給予含或不含DOX的飲食,待移植瘤模型建立穩(wěn)定后,每組分別取出3只裸鼠的移植瘤組織,用乳酸脫氫酶檢測試劑盒檢測組織內(nèi)LDH的活性。5.監(jiān)測人腫瘤移植模型裸鼠的總生存期,繪制生存曲線。結(jié)果1.成功建立了LDHa基因表達(dá)下調(diào)的ATC原位裸鼠移植瘤模型。2.實驗組裸鼠腫瘤生長慢于對照組,接種1周后小動物活體熒光成像系統(tǒng)顯示實驗組熒光強(qiáng)度顯著低于對照組(P=0.003)。且實驗組裸鼠剝除的瘤體體積及重量小于對照組(P=0.0031和P=0.002)。3.LDHa蛋白表達(dá)量在實驗組腫瘤組織中的表達(dá)低于對照組(P=0.286)。4.乳酸脫氫酶活性在實驗組腫瘤組織中的表達(dá)低于對照組(P=0.231)。5.實驗組人腫瘤移植模型裸鼠的總生存期長于對照組裸鼠的總生存期。結(jié)論1.oncomine數(shù)據(jù)庫中提示LDHa在甲狀腺未分化癌中高表達(dá),提示LDH在甲狀腺未分化癌中有良好的研究前景。2.抑制LDHa基因能夠有效抑制Hth83細(xì)胞的增殖及腫瘤克隆的形成,但對細(xì)胞的遷徙能力及細(xì)胞周期無顯著影響。3.LDHa或LDHb表達(dá)的抑制,均能夠有效的降低Hth83細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶的活性,并暫時性的降低了乳酸的濃度。4.慢病毒轉(zhuǎn)染的方法沉默LDHa、LDHb,對Hth83細(xì)胞系乳酸脫氫酶、乳酸的產(chǎn)生均有抑制作用;但沉默LDHa的效果要好于沉默LDHb。5.裸鼠體內(nèi)表達(dá)shLDHa可抑制LDHa蛋白的生成和酶的活性。6.裸鼠體內(nèi)抑制LDHa,可顯著抑制人甲狀腺癌移植瘤的生長,延長了異種移植瘤裸鼠的生存期。提示LDHa有可能作為ATC患者的潛在治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R736.1
【部分圖文】：

結(jié) 果重組慢病毒 Lenti-shLDHa 及 Lenti-shLDHb 的制備、鑒定 oncomine 數(shù)據(jù)庫檢測 LDH 基因在甲狀腺癌中的表達(dá)圖 1 中我們看出，不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa、LDHb 表達(dá)有差異，在甲狀腺未分化癌中，LDHa 表達(dá)水平較高。

oncomine 數(shù)據(jù)庫檢測 LDH 基因在甲狀腺癌中的表達(dá)圖 1 中我們看出，不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa、LDHb 表達(dá)有差異甲狀腺未分化癌中，LDHa 表達(dá)水平較高。圖 1A 不同病理類型的甲狀腺癌 LDHa 的表達(dá)

慢病毒的包裝、制備、滴度測定和對 Hth-83 細(xì)胞感染效率的慢病毒載體構(gòu)建乳酸脫氫酶可調(diào)節(jié)表達(dá)的短發(fā)夾干擾 Hth83-hLDHb 細(xì)胞系。配制磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系，該體系與 293T 細(xì)胞共后觀察熒光情況，48 小時后再次觀察熒光情況，并收集病毒上的方法來測定病毒的滴度。測定結(jié)果顯示濃縮后的四種病毒FU/mL。通過對 Hth83 細(xì)胞的感染效率測定發(fā)現(xiàn)，當(dāng) MOI=80胞的效率可達(dá) 75%以上，可以滿足進(jìn)一步的實驗需求，見圖

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7 張寰;昆蟲脂肪體細(xì)胞體外增殖方法及同源病毒敏感脂肪體細(xì)胞系建立研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2006年

8 林雪梅;青蒿琥酯對K562細(xì)胞系CD34～+細(xì)胞的作用及分子機(jī)制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

9 朱紅;HaCaT細(xì)胞系與皮膚鱗癌細(xì)胞系SCL-1蛋白質(zhì)組差異分析的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

10 梁道明;重組人生長激素對人胃癌裸鼠移植瘤及骨髓的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳慶;OSBPL2基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建及其功能的初步研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

2 李子航;基于CRISPR/Cas9靶向基因組修飾技術(shù)的SREBPs-T2A-luciferase Knock-in細(xì)胞系建立及實驗研究[D];陜西師范大學(xué);2018年

3 李富強(qiáng);人BCCIP蛋白表達(dá)純化與過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建[D];吉林大學(xué);2018年

4 張莉;穩(wěn)定表達(dá)gBST-2蛋白Vero細(xì)胞系的構(gòu)建及其對PPRV增殖特性的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 謝簡明;依布硒啉阻滯及逆轉(zhuǎn)HIF-1α在A549細(xì)胞系中介導(dǎo)的多藥耐藥的研究[D];江蘇大學(xué);2018年

6 劉騰;穩(wěn)定支持小反芻獸疫病毒增殖的永生化羊源細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

7 石璐璐;細(xì)胞系特異的可變剪切數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及其組蛋白修飾特征的分析[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

8 翁雷;利用結(jié)合Xist第一內(nèi)含子的Tale-dTF建立R6-MEF細(xì)胞系[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2017年

9 秀花;組蛋白修飾在兩細(xì)胞系上的分布分析[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

10 李和珍;膠質(zhì)瘤研究兩種常用細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號：2822962