發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 14:05

　　 對(duì)羥基苯甲酸,香蘭素等酚類化合物廣泛應(yīng)用于人們的日常生活。雖然這些化合物可通過化學(xué)合成,然而,在食品,化妝品和制藥等應(yīng)用領(lǐng)域,人們更青睞天然或生物合成的產(chǎn)品。因此,利用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)酚類衍生物的前景廣闊。另外,通過異養(yǎng)微生物利用二氧化碳合成一些有價(jià)值的化合物是一種很有前景的生物合成手段。本研究以大腸桿菌為出發(fā)菌株,導(dǎo)入相應(yīng)羧化酶和還原酶基因構(gòu)建基因工程菌,以實(shí)現(xiàn)對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行加羧和對(duì)羧基進(jìn)行還原等生物合成過程。本研究將來自枯草芽孢桿菌168的羧化酶基因ylBCCD,來自諾卡氏菌NRRL 5646中羧酸還原酶基因car和來自枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶Sfp連接到pETDuet質(zhì)粒,構(gòu)建了pETDuet-yclBCD-car-s p質(zhì)粒;將絲孢酵母菌WU-0401的水楊酸脫羧酶基因Sdc,以及來自諾卡氏菌NRRL 5646中羧酸還原酶基因car和來自枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰疏基轉(zhuǎn)移酶sfp連接到pETDuet質(zhì)粒,構(gòu)建了pETDuet-sdc-car-sfp質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒分別導(dǎo)入到在大腸桿菌B121(DE3)中,構(gòu)建了 pETDuet-yclBCD-car-sfp/B121(DE3)和pETDuet-sdc-car-sfp/B121(DE3)重組菌株。在有氧條件下,以苯酚和碳酸氫鈉(提供C02)為底物,進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn),用高效液相色譜儀和液質(zhì)聯(lián)用色譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了分析,分別考察了兩株重組菌對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力。發(fā)現(xiàn)重組菌pETDuet-yclBCD-car-sfp/B121(DE3)不僅可以轉(zhuǎn)化苯酚和CO2生成4-羥基苯甲酸,同時(shí)還有還原產(chǎn)物4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲醇生成。含重組質(zhì)粒pETDuet-yclBCD-car-sfp的工程菌經(jīng)12h發(fā)酵最終得到4-羥基苯甲醇11.331±1.882 mg/l。然而,同樣條件下以愈創(chuàng)木酚和碳酸氫鈉為底物并沒有檢測(cè)到預(yù)期加羧和還原產(chǎn)物,說明羧化酶YCLBCD對(duì)底物具有特異性,并不能催化愈創(chuàng)木酚的加羧。另外,以苯酚和碳酸氫鈉(提供C02)為底物,用含質(zhì)粒pETDuet-sdc-car-sfp的重組菌發(fā)酵只得到加羧產(chǎn)物水楊酸,未檢測(cè)到還原產(chǎn)物水楊醛或水楊醇,證明水楊酸脫羧酶Sdc可以催化苯酚加羧生成水楊酸,而羧酸還原酶CAR并不能催化水楊酸還原。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

脫羧酶催化２，邋６－二羥基苯甲酸酯和２，邋３－二羥基苯甲酸酯的非氧化脫羧作用，不需要逡逑任何輔助因子。還有一些脫羧酶可以在需氧條件下催化羧化過程。逡逑發(fā)現(xiàn)水楊酸脫羧酶可以可逆地催化苯酚和Ｃ0２反應(yīng)生成水楊酸（圖１－１）。Ｌｕｐａ等報(bào)逡逑道了一種來自枯草芽孢桿菌的可逆非氧化香草酸／４－羥基苯甲酸脫羧酶，其可以在有氧逡逑和無氧條件下使香草酸和４－羥基苯甲酸脫羧［５８：６６］。這些過程可以可逆地進(jìn)行，并且羧逡逑化不需要ＡＴＰ，并且其中沒有顯著的能量變化。因此，這一步驟不是牢固的碳固定過逡逑程。從合成生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，合成的化合物種類受到限制，僅得到少量苯甲酸衍生逡逑物。如果引入的羧基可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到其它基團(tuán)，貝Ｕ不僅富含Ｃ０２添加到酚類底物的逡逑產(chǎn)物，而且可以獲得許多有價(jià)值的化合物。例如，據(jù)報(bào)道，天麻蛋白，即４－羥甲基苯逡逑基Ｐ邋－Ｄ－ｆｌ比喃葡萄糖苷被鑒定為Ｇ．邋ｄａｔａ邋Ｂｌｕｍｅ的主要活性成分，并被廣泛用于治療各逡逑種疾病如頭痛

圖１－２諾卡氏菌ＮＲＲＬ邋５６４６中ＣＡＲ催化的還原反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋Ｎｏｃａｒｄｉａ邋ｓｐ．邋ｓｔｒａｉｎ邋ＮＲＲＬ邋５６４６ＣＡＲ．逡逑

＾邋＾邋６ｉ＾ＡＭｐ逡逑Ｃｊ邋Ｈ邋Ｑ＾ｈ，．邋ｎａｄｐｈ邋￣0Ａｃａｒ＂逡逑＋邋ＡＭＰ逡逑圖１－２諾卡氏菌ＮＲＲＬ邋５６４６中ＣＡＲ催化的還原反應(yīng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋Ｎｏｃａｒｄｉａ邋ｓｐ．邋ｓｔｒａｉｎ邋ＮＲＲＬ邋５６４６ＣＡＲ．逡逑１．２．３．大腸桿菌內(nèi)生成４－羥基苯甲酸的機(jī)理逡逑在大腸桿菌中分支酸是合成許多芳香化合物前體物質(zhì)［７５］，分支酸合成代謝的主要逡逑七種終產(chǎn)物是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、輔酶Ｑ、４－氨基，甲基萘醌類和腸菌素。逡逑Ｍａｒｉｏｎ等人在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)基因Ｍ／ｃ編碼的分支酸裂解酶（ＣＰＬ）直接催化分支逡逑酸生成４－經(jīng)基苯甲酸［７６］。杜邦公司的Ｖｉｉｔａｎｅｎ等［７７］和Ｓｏｍｍｅｒ等［７８；７９］把大腸桿菌逡逑的Ｍ／ｃ？基因轉(zhuǎn)化到煙草的葉綠體染色體上，并在其上游插入在葉綠體中特異轉(zhuǎn)錄的逡逑啟動(dòng)子�；蛟跓煵莸娜~綠體內(nèi)表達(dá)成功，并合成了邋４－羥基苯甲酸。在輔酶Ｑ逡逑合成途徑中分支酸裂解酶（ＣＰＬ）催化分支酸生成４－羥基苯甲酸是第一步反應(yīng)（如圖逡逑１－３）。大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)逡逑操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉，可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的逡逑蛋白等優(yōu)點(diǎn)，而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的逡逑目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的３０邋％

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2822597