禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendosiliosis virus,REV)引起的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis,RE)是一種重要的禽類免疫抑制性疾病和腫瘤性疾病,REV不僅可以感染雞,還能夠感染野雞、鴨、火雞、鵪鶉、鵝等。REV既能夠垂直傳播,也可以水平傳播,除此之外使用了被REV污染的弱毒疫苗也是導(dǎo)致REV廣泛流行的重要原因之一。目前,種源凈化是徹底解決REV傳播的最主要途徑,但是迄今為止,還沒(méi)有哪個(gè)國(guó)家專門提出針對(duì)REV的凈化計(jì)劃。本研究以一株REV疫苗污染毒核酸為模板,成功表達(dá)了其gp90蛋白并制備了針對(duì)gp90蛋白的單克隆抗體,將該蛋白與免疫佐劑CpG-ODN聯(lián)合應(yīng)用成功誘導(dǎo)母雞產(chǎn)生針對(duì)REV的抗體并保護(hù)雛雞抵抗REV感染,為REV的檢測(cè)和防控提供了新的技術(shù)儲(chǔ)備。1.REV gp90蛋白的表達(dá)及抗REV間接ELISA方法的建立以REV疫苗污染株IBD-C1605株的前病毒全基因cDNA克隆質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1,200 bp的env-gp90基因片段,成功構(gòu)建了PET-28a-gp90表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、并通過(guò)SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測(cè),顯示gp90蛋白獲得高效表達(dá)。對(duì)包涵體蛋白洗滌、溶解,4℃復(fù)性后純化。對(duì)該蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果顯示,REV單克隆抗體11B118能夠很好地識(shí)別gp90重組蛋白,該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。將純化后的gp90蛋白作為包被抗原,建立了抗REV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。優(yōu)化ELISA的最佳工作條件,結(jié)果顯示為抗原的包被的最佳濃度是10 mg/mL,一抗的最佳稀釋度1:500,二抗最佳稀釋度1:5000,最佳包被液TBST,最佳顯色時(shí)間10 min。經(jīng)過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、對(duì)比試驗(yàn)的結(jié)果顯示本研究建立的ELISA方法重復(fù)性好,標(biāo)準(zhǔn)差均小于15%;特異性強(qiáng),與馬立克氏病毒(Marik’s disease virus,MDV)、禽白血病病毒(Avain leukosis virus,ALV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、禽痘病毒(Fowlpox virus,FPV)等病毒的陽(yáng)性抗體均不能產(chǎn)生交叉反應(yīng);結(jié)果可靠性好,與間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)準(zhǔn)確性的吻合率都超過(guò)90%。2.抗REV-gp90蛋白單克隆抗體的制備gp90蛋白純化后,免疫BALB/c小鼠,用PEG2000介導(dǎo)BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,篩選單克隆抗體,4代之后,得到了1株能穩(wěn)定分泌REV-gp90單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A12D。進(jìn)一步分析表明,gp90蛋白可以被1A12D株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體特異性的識(shí)別,同時(shí)也能夠特異性地識(shí)別REV全病毒。向經(jīng)石蠟致敏的BALB/c小鼠注射該株雜交瘤細(xì)胞,制備腹水,檢測(cè)小鼠腹水所含抗體效價(jià),結(jié)果顯示均超過(guò)1.2×10~4;建立檢測(cè)REV間接免疫熒光(IFA)的方法,用該方法對(duì)MDV、ALV、FPV、IBDV、NDV等幾種常見(jiàn)的雞病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn),結(jié)果均呈陰性,說(shuō)明該方法對(duì)REV檢測(cè)具有高度特異性。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法具有良好的可重復(fù)性,穩(wěn)定性強(qiáng)。3.齊多夫定和單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用去除疫苗毒種中REV的污染為了將污染REV的某傳染性法氏囊病疫苗的種毒進(jìn)行純化,將所制備的單克隆抗體同核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑類藥物齊多夫定(Azidothymidine,AZT)分別單獨(dú)使用及聯(lián)合應(yīng)用來(lái)去除疫苗毒種中REV的污染。將污染REV的IBDV疫苗毒種接種DF-1細(xì)胞后,分別經(jīng)5μg/mL的AZT,5%的McAb或兩者聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)后,毒種中污染的REV復(fù)制受到了明顯的干擾,特別是經(jīng)過(guò)AZT與McAb聯(lián)合應(yīng)用兩次干預(yù)后,檢測(cè)REV為完全陰性,經(jīng)檢驗(yàn)傳染性法氏囊毒種純化合格。4.gp90蛋白協(xié)同分子佐劑CpG-ODN誘導(dǎo)母源抗體保護(hù)雛雞抵抗REV的感染為進(jìn)一步觀察所表達(dá)gp90蛋白的免疫原性,將純化后的gp90蛋白協(xié)同免疫佐劑CpG-ODN使用于開(kāi)產(chǎn)SPF母雞10只,連續(xù)免疫8周,同時(shí)對(duì)母雞血清以及卵黃抗體進(jìn)行REV抗體水平檢測(cè),繪制抗體動(dòng)態(tài)曲線,結(jié)果顯示在免疫后母雞血清及卵黃抗體均到達(dá)較高水平。將該雞胚進(jìn)行人工授精,孵化后檢測(cè)1日齡雛雞的母源抗體水平,選取抗體陽(yáng)性雞進(jìn)行人工攻毒試驗(yàn),以1日齡抗體陰性的SPF雛雞作為對(duì)照組。結(jié)果顯示,有母源抗體的雛雞REV病毒血癥陽(yáng)性率從一周齡的50%最后下降至10%,而對(duì)照組的病毒血癥陽(yáng)性率從第一周的80%下降到最后的50%,說(shuō)明母源抗體能夠保護(hù)大部分雛雞免受REV感染。綜上所述,本研究研制的針對(duì)gp90蛋白的單克隆抗體在檢測(cè)和去除REV污染中均可發(fā)揮有效作用,并可與分子佐劑聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生母源抗體保護(hù)雛雞抵抗REV的感染。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

REV病毒結(jié)構(gòu)示意圖

圖 2 REV基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Genome of Reticuloendotheliosis virus陷型禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒可以在幾種禽類細(xì)胞中增殖，特別是雞胚、鶉成纖維細(xì)胞最常用。李勁松報(bào)道，用鴨胚、鴨腎細(xì)胞也能很好地繁殖病毒成纖維細(xì)胞很適合于細(xì)胞病變的觀察。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒在其他細(xì)

圖 3 AZT 化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structure of AZT圖 4）：由于脫氧胸腺嘧啶核苷酸（T）與 AZ的過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄酶錯(cuò)將 AZT 加以利用，但與另一邊的核糖核酸上的 5’的羥基與磷酸

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本文編號(hào)：2822505