細胞質雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑。前人研究成果表明,細胞質雄性不育與能量代謝有關,能量代謝失衡會引起花粉異常發(fā)育。丙酮酸脫氫酶(PDC)是生物體能量代謝的樞紐,通過催化能源物質丙酮酸氧化脫羧,將糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑聯(lián)系起來。丙酮酸脫氫酶E1α亞基是PDC活性的關鍵調控部位,PDK與PDP通過對PDC-E1α亞基絲氨酸的羥基基團進行磷酸化/去磷酸化反應,共同調節(jié)PDC活性的穩(wěn)態(tài),本研究以棉花細胞質雄性不育系晉A、亞棉A及其各自的同核異質保持系為研究對象,克隆了GhPDC-E1α、GhPD 與GhPDP的基因組DNA和cDNA;分析了三個基因在小孢子不同發(fā)育時期的表達模式;測定了小孢子不同發(fā)育時期的丙酮酸含量,初步研究了能量代謝異常對棉花小孢子發(fā)育的影響。研究結果如下:1.采用同源克隆的方法,獲得了GhPDC-E1α、和GhPDP基因組DNA和cDNA序列。結果顯示:GhPDC-E1α在不育系和保持系中基因組DNA長度不同,在晉A、亞棉A不育系和保持系中分別為8655bp、8672bp、8658bp,含有8個外顯子和7個內含子;cDNA全長均為1185bp,編碼394個氨基酸,氨基酸序列在不育系和保持系間存在單個位點的差異:通過氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn):PDC-E1α在植物中高度保守,含保守的TPP結合結構域、4個保守功能區(qū)以及兩個絲氨酸磷酸化位點。對GhPDK基因組DNA和cDNA進行克隆,結果表明:在不育系和保持系中GhPDK基因組DNA全長均為2232bp,由6個外顯子和5個內含子組成;cDNA全長為1110bp,編碼369個氨基酸,不育系與保持系中GhPDK氨基酸序列相似度達到99%;保守結構域分析發(fā)現(xiàn),PDK在植物中高度保守,含有類組氨酸激酶結構域,可以進行自磷酸化。對GhPDP基因組DNA和cDNA進行克隆,結果表明:GhPDP在不育系和保持系中基因組DNA長度不同,在晉A、亞棉A不育系和保持系中分別為2007bp、2016bp、2008bp,均含有4個外顯子和3個內含子:cDNA全長均為1152bp,編碼383個氨基酸。該基因屬于PP2C家族蛋白,依靠Mn2+發(fā)揮活性,結構域保守。2.采用qRT-PCR,以小孢子敗育前、敗育時期、敗育后3個時期的花蕾為研究材料,對GhPDC-E1α、GhPDK和GhPDP基因的表達模式進行分析。結果表明:在小孢子敗育前,晉A不育系中GhPDC-E1α的表達量與保持系無差別,而在小孢子敗育時期和敗育后卻均極顯著低于保持系;在小孢子敗育前和敗育后時期,GhPDK的表達量均極顯著高于保持系,在小孢子敗育時期差異不顯著;GhPDP的表達量在整個小孢子發(fā)育過程中均顯著高于保持系;而保持系中GhPDK和GhPDP的表達量在小孢子發(fā)育過程中均無顯著變化。可能由于GhPDP過表達,使晉A不育系在小孢子敗育時期代謝過強,ROS增多,使膜脂過氧化,從而引起絨氈層提前降解,導致花粉敗育。在小孢子發(fā)育過程中,亞棉A不育系中GhPDC-E1α的表達量與保持系無差別,而在小孢子敗育時期和敗育后卻均極顯著低于保持系;GhPDK的表達量均低于保持系,且在敗育前和敗育時期表達量差異極顯著,敗育后差異不顯著;GhPDP的表達量在小孢子敗育前和敗育時期與保持系相差不大,而敗育后顯著低于保持系。推測可能由于亞棉A不育系中GhPDC-E1α亞基蛋白含量低于正常水平,可能會抑制丙酮酸轉化為乙酰輔酶A,導致不能產生足夠的能量來滿足小孢子的發(fā)育,從而引起花粉敗育。綜合分析GhPDC-E1α、GhPDK、GhPDP基因在不育系和保持系間的表達特征并結合我們之前的研究認為,晉A、亞棉A兩種細胞學敗育特征不同的細胞質雄性不育系,雖然在小孢子發(fā)育過程中,均出現(xiàn)能量代謝異常,但導致小孢子敗育的機理不同。3.對不育系和保持系小孢子發(fā)育過程中丙酮酸含量進行測定。結果表明,晉A不育系中丙酮酸含量在小孢子發(fā)育過程中與保持系無顯著差異,說明晉A不育系小孢子的敗育并不是由于能量代謝底物差異造成的,可能是由于其能量代謝途徑中的酶調控失衡引起的。亞棉A不育系在小孢子發(fā)育過程中丙酮酸含量均高于保持系,且在小孢子敗育時期差異顯著,丙酮酸的積累可能抑制三羧酸循環(huán)的進行,導致小孢子發(fā)育過程中能量不足。
【學位單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S562
【部分圖文】：

圖２－１邋ｉＰＤＣ－￡７ａ轉錄組測序序列ＢＬＡＳＴｎ結果逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＢＬＡＳＴｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＰＤＣ－ＥＩａ逡逑使用ｐｒｉｍｅｒ邋ｐｒｅｍｉｅｒ６．０軟件根據(jù)轉錄組測序結果基因，設計一對特異逡逑性引物ＰＤＣ－Ｅｌａ－Ｆ／ＰＤＣ－Ｅｌａ－Ｒ，用于Ｇ／ｙＰＤＣ－ｉ＾ａ基因ｃＤＮＡ擴增。根據(jù)中棉所陸逡逑地棉全基因組測序結果（ｃ加５２如Ｓ邋）分段設計引物，引物名稱分別為逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－１Ｆ／ＰＤＣ－Ｅｌａ－１Ｒ、ＰＤＣ－Ｅｌａ－２Ｆ／ＰＤＣ－Ｅｌａ－２Ｒ、ＰＤＣ－Ｅｌａ－３Ｆ／邋ＰＤＣ－Ｅｌａ－３Ｒ、逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－４Ｆ／ＰＤＣ－Ｅｌａ－４Ｒ、ＰＤＣ－Ｅｌａ－５Ｆ／ＰＤＣ－Ｅｌａ－５Ｒ邋用于邐基因組邋ＤＮＡ逡逑擴增，引物序列見表２－１。逡逑表２－１邋Ｃ７／７ＰＤＣ－Ｅ／Ｇ（弓丨物序列逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－１邋ＧｈＰＤＣ－Ｅｌａ邋Ｐｒｉｍｅｒ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑Ｐｒｉｍｅｒ邐Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邐Ｌｅｎｇｔｈ邐Ｔｍ逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－Ｆ邐ＣＣＧ邋ＣＣＡ邋ＴＣＴ邋ＣＴＴ邋ＡＡＴ邋ＡＣＧ邋Ａ邐１９邐５４．３逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－Ｒ邐ＡＣＴ邐ＴＧＧ邐ＡＡＧ邋ＡＧＣ邋ＴＧＧ邋ＴＴＡ邋Ｃ邐１９邐５３．２逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－ＩＦ邐ＣＣＡ邋ＣＴＡ邋ＡＧＴ邋ＡＡＧ邋ＡＧＡ邋ＴＴＣ邋ＧＴ邐２０邐４７．９逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－ＩＲ邐ＣＡＴ邋ＣＣＡ邋ＴＴＣ邋ＣＡＴ邋ＣＣＡ邋ＣＣＴ邋Ａ邐１９邐５０．９逡逑ＰＤＣ－Ｅｌａ－２Ｆ邐ＧＴＧ邋ＧＡＴ邋ＧＧＡ邋ＡＴＧ邋ＧＡＴ邋ＧＣＴ邐１８邐５２逡逑

圖２－２邋ＲＮＡ檢測圖逡逑－

不育系晉Ａ、亞棉Ａ與保持系ｃＤＮＡ序列相似度達９９％。在ＮＣＢＩ中進逡逑行序列比對，發(fā)現(xiàn)擴增片段與陸地棉ＰＤＣ－￡／ｃｔ核苷酸序列高度一致，相似度為９９％，逡逑說明所克隆基因確實為Ｇ／７ＰＤＣ－￡／ｃｔ邋（圖２－４）。逡逑＜Ｃ：－ｏｆｏｒ－邋Ｕｃ＊Ｓ�。埽蝈澹В妫铮姡螅睿铮幔颍浚幔螅蓿义希祝瓦姡矗板澹澹樱线姡樱襄澹澹常斑�？ｏ－＾：ｏｏ逡逑，邋，邋ｔ邋！逡逑Ｘ邐＾２００邐＾ｆｃＯＯ邐＾ＯＯ邐ＯＯＯ邐ＶＳＬＯＯＯ逡逑Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邐、ａｘ邋Ｔｏｉａｉ邋Ｑｕｅｒｙ邋丨邋Ｅ邐Ａｃｃｓｓｓｆａｎ逡逑：ｓｏｃｒｓ邋ｓｃｏｒ？邋ｃｏｖｅｒ邋ｖｓＪｕｅ逡逑．公拖．３於池奴}~T碰匆滬泛？NB郵ａｆ？栥．０＾．５０７的炫游艦：＜|䙌0ＸＩ：？ｔ７２邋”７２邋１Ｓ３％邋０３邋５ｄ＜？．邋Ｍ－＾１６８３１２０２，１逡逑■Ｓａ跑迦ＯｌＭｌ脫泣衛(wèi)＾Ｓｉ＾＾ａｍｉａ￡Ｌ~=^蠛絘桑糝瞺枺�？yU趾規(guī)}0２１？６邋１０５％邋３．０邋５５％邋y＿￡１５

本文編號：2820056