二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是一種ω-3系列長鏈多不飽和脂肪酸,具有抗凝血、預(yù)防心血管疾病、降血脂等特殊生理功能,在保健品、食品和飼料行業(yè)均有較多的應(yīng)用。產(chǎn)油微生物高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已用于工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(Arachidonic acid,AA),其AA產(chǎn)量約占總脂肪酸的50%,常溫條件下不產(chǎn)EPA,低溫條件下EPA產(chǎn)量僅占總脂肪酸含量的2%左右。ω-3脂肪酸脫飽和酶具有催化AA生成EPA的作用,是ω-3長鏈多不飽和脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。本實驗室前期成功將來源于寄生疫霉的脂肪酸脫飽和酶oPpFADS17在高山被孢霉中進(jìn)行表達(dá),重組菌中EPA含量顯著提高。而還原力NADPH在脂肪酸合成過程中起關(guān)鍵作用,實驗室前期成功將產(chǎn)生還原力的關(guān)鍵基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2在高山被孢霉中進(jìn)行了表達(dá),重組菌中總脂肪酸含量得到提升。本文為了同步提高高山被孢霉中總脂含量和EPA含量,嘗試應(yīng)用雙表達(dá)盒策略和2A肽策略在高山被孢霉中同時表達(dá)ω-3脂肪酸脫飽和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2基因,分析兩種基因?qū)Ω呱奖绘呙怪亟M菌合成EPA的作用。本課題主要結(jié)果如下:1.雙表達(dá)盒策略中ω-3脫飽和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2共表達(dá)重組菌中總脂含量提高了20%左右。通過在表達(dá)載體上引入兩個表達(dá)框,高山被孢霉重組菌總脂含量比野生型高山被孢霉提高了20%左右,G6PD2基因轉(zhuǎn)錄水平比野生型高山被孢霉提高了3-5倍,酶活水平比野生型高山被孢霉提高2倍左右,NADPH水平比野生型高山被孢霉提高了20%左右;實驗結(jié)果分析表明,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在高山被孢霉重組菌中成功過表達(dá),且有效促進(jìn)高山被孢霉重組菌脂質(zhì)的合成。高山被孢霉重組菌中EPA含量沒有達(dá)到理論預(yù)期含量,我們首先從基因轉(zhuǎn)錄的角度進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)高山被孢霉重組菌中ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因的轉(zhuǎn)錄水平比對照重組菌M.alpina-oPpFADS17降低20%左右;據(jù)此,我們推測ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因轉(zhuǎn)錄水平降低導(dǎo)致了高山被孢霉重組菌檢測不到EPA含量的提高。2.2A肽策略中ω-3脫飽和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2共表達(dá)重組菌中EPA含量提高到占總脂含量的30.6%,AA轉(zhuǎn)化為EPA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到77%。實驗結(jié)果顯示,與野生型高山被孢霉相比,高山被孢霉重組菌EPA產(chǎn)量提高到30.6%。轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,高山被孢霉重組菌中ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因的轉(zhuǎn)錄水平提高了20%左右,而葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生型高山被孢霉相當(dāng);酶活水平和NADPH水平結(jié)果顯示,重組菌中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2的活性及其提供的還原力NADPH與野生型高山被孢霉相當(dāng)。據(jù)此,2A肽策略中過表達(dá)ω-3脫飽和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD2基因能夠顯著提高高山被孢霉重組菌中EPA含量,由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶所提供的還原力NADPH沒有顯著增加,造成了高山被孢霉重組菌中脂肪酸含量沒有提高。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

圖 1-1 EPA 的結(jié)構(gòu)式Fig. 1-1 Chemical structure of EPA中，亞麻籽油含有 58%的 ALA，酸脫飽和酶（Fatty acid desatura來源于植物油脂的 ω-3 多不飽和PA 經(jīng)“Sprecher”途徑生成 DPA后經(jīng) β-氧化脫去兩個碳生成 D常低（小于 1%），EPA、DHA 3 PUFAs 大多直接來源于食物。E取，因此人們多從以富含 ω-3 PU EPA、DHA 的含量最高，如鯡HA 占總脂肪酸的 10.8%左右[18]。對海洋魚類的過度捕撈使得海洋找新的可持續(xù)的 ω-3 PUFAs 替代 PUFAs 來源的不足，是理想的

緒 論一種高產(chǎn)脂質(zhì)的絲狀真菌，其總脂含量可以達(dá)到細(xì)胞干重的 50%左右。該菌廣泛存在土壤中，營腐生生活，以分生孢子進(jìn)行無性繁殖，具有接合真菌典型的無性生殖方式[2（圖 1-2）。當(dāng)在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長時，菌落形態(tài)呈白色玫瑰花瓣狀，表面有棉狀菌絲體，產(chǎn)少量乳白色孢子。顯微鏡下觀察可以看到菌絲內(nèi)部含有大量油滴，如圖 1所示。高山被孢霉合成的 AA 已經(jīng)通過美國食品藥物管理局的安全性評估，它可以作食品級的工業(yè)產(chǎn)油微生物，同時也是脂質(zhì)生物化學(xué)基礎(chǔ)研究的重要模式微生物[22]。本驗室已對 M.alpina ATCC32222 進(jìn)行了全基因組測序及轉(zhuǎn)錄組信息的分析，并對其脂合成途徑進(jìn)行了全面解析[23]。

圖 1-2 高山被孢霉生活史和菌絲顯微形態(tài)Fig. 1-2 The microscopic phenotypes of M. alpina mycelia高山被孢霉合成多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展 高山被孢霉 PUFAs 合成途徑山被孢霉內(nèi)多不飽和脂肪酸的合成主要由底物乙酰輔酶 A，脂肪酸合酶和通過脂肪酸進(jìn)行一系列的脫飽和及碳鏈延長來完成的（圖 1-3）。脂肪酸合產(chǎn)物一般是 C16:0，其他脂肪酸都以 C16:0 為前體合成而來。C16:0 經(jīng)延酶合成 LA 和 ALA。LA 作為 ω-6 系列 PUFAs 的最初產(chǎn)物，ALA 作為 ωs 的最初產(chǎn)物，經(jīng) FADS6、ELO6、FADS5 的催化作用分別形成最終產(chǎn)物此外，ω-6 系列的脂肪酸經(jīng) ω3 脫飽和酶作用后可被轉(zhuǎn)化為 ω-3 系列脂肪

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱貴明;Abdulmomen Ali Mohammed Saleh;Said Ahmed Bahwal;邱立紅;孫潔;商宇;江旭東;葛堂棟;張濤;;哺乳動物細(xì)胞多不飽和脂肪酸合成酶系的重建將亞油酸代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎剂┧醄J];生物工程學(xué)報;2015年02期

2 張哲;李同明;曾勇慶;陳偉;徐正剛;楊云;房國鋒;王守棟;楚青惠;;2A肽介導(dǎo)豬PID1與CuZnSOD雙基因真核共表達(dá)載體的構(gòu)建與細(xì)胞表達(dá)[J];生物學(xué)雜志;2014年06期

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4 易紹金;鄭義平;;產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用[J];中外能源;2006年02期

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1 史海粟;Δ6脂肪酸脫飽和酶底物選擇性研究及其在高山被孢霉中的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2016年

2 唐鑫;產(chǎn)油真菌卷枝毛霉WJ11高產(chǎn)脂質(zhì)的分子機(jī)制[D];江南大學(xué);2016年

3 郝光飛;高山被孢霉脂肪酸合成過程轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和還原力來源研究[D];江南大學(xué);2014年

4 張白曦;亞油酸異構(gòu)酶基因在產(chǎn)油真菌中的異源表達(dá)及產(chǎn)物的生物合成[D];江南大學(xué);2013年

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1 潘淼;高山被孢霉原生質(zhì)體融合及全合成培養(yǎng)基研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2017年

2 郝丹輝;高山被孢霉生物合成共軛亞油酸重組菌株的構(gòu)建及研究[D];江南大學(xué);2015年

本文編號：2817664