第一部分第二代測(cè)序技術(shù)在晚期非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)小標(biāo)本基因檢測(cè)中的應(yīng)用背景:支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下經(jīng)支氣管針吸活檢術(shù)(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA)是一種常用的對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)診斷的微創(chuàng)技術(shù),但其獲得的組織相對(duì)較少。本研究旨在明確靶向捕獲第二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)對(duì)EBUS-TBNA標(biāo)本的檢測(cè)效能,從而指導(dǎo)晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的診療。方法:本研究前瞻性入組高度懷疑NSCLC非鱗癌的IIIA-IV期初診患者進(jìn)行EBUS-TBNA操作,獲取轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織標(biāo)本,并對(duì)標(biāo)本進(jìn)行福爾馬林固定、石蠟包埋處理。對(duì)組織標(biāo)本明確診斷為NSCLC非鱗癌的患者,分別采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)、免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行EGFR、ALK和ROS1傳統(tǒng)方法基因檢測(cè),對(duì)剩余標(biāo)本進(jìn)行56基因靶向捕獲NGS檢測(cè)。結(jié)果:77例明確診斷為NSCLC非鱗癌的患者最終成功進(jìn)行了傳統(tǒng)方法和NGS檢測(cè)。傳統(tǒng)方法在EGFR、ALK和ROS1三個(gè)基因中共檢測(cè)出41個(gè)突變,均被NGS檢測(cè)出來(lái)。以傳統(tǒng)方法作為參考,NGS與傳統(tǒng)方法檢測(cè)一致率達(dá)到100%。此外,NGS檢測(cè)出4個(gè)額外的EGFR基因突變,因傳統(tǒng)方法中EGFR基因檢測(cè)試劑盒缺乏這些突變位點(diǎn)而未被檢測(cè)出來(lái)。NGS亦檢測(cè)出很多其他的經(jīng)典驅(qū)動(dòng)突變,包括6個(gè)KRAS突變,1個(gè)BRAF突變,1個(gè)RET融合,1個(gè)MET擴(kuò)增和EGFR L858R雙突變,1個(gè)KRAS擴(kuò)增和EGFR 19del雙突變,1個(gè)ERBB2擴(kuò)增。成功進(jìn)行傳統(tǒng)方法和NGS檢測(cè)的淋巴結(jié)平均穿刺次數(shù)為5.2次。結(jié)論:NGS可以在不增加EBUS-TBNA標(biāo)本的情況下表現(xiàn)出較好效能,并能反映腫瘤基因變異全貌,對(duì)晚期肺癌的治療決策具有重要意義。第二部分晚期非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和血液中基因突變一致性研究背景:肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶基因突變狀態(tài)一致性情況已有很多報(bào)道,但兩者是否可以相互替代以指導(dǎo)治療仍存在爭(zhēng)議;液體活檢作為一種無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)手段,與組織活檢具有高度一致性,可以克服組織活檢產(chǎn)生的偏倚,但其是否可以反映腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶基因突變狀態(tài)的差異尚不太清楚。方法:本研究前瞻性入組高度懷疑(non-small cell lung cancer,NSCLC)非鱗癌的IIIA-IV期初診患者,收集同一患者的原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血標(biāo)本,最終入組原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)均明確診斷為NSCLC非鱗癌的患者。組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋處理,血液標(biāo)本經(jīng)離心分離出血漿及白細(xì)胞,對(duì)三種標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行56基因的靶向捕獲第二代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS),從而探索三種標(biāo)本中基因突變狀態(tài)的一致性和異質(zhì)性。結(jié)果:晚期NSCLC原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血基因突變按變異類型計(jì)算一致率為62.0%(67/108),原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、原發(fā)灶和外周血、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和外周血中基因突變一致率分別為76.4%(81/106)、68.4%(67/98)、73.2%(71/97)。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)基因突變完全一致與部分一致患者經(jīng)靶向治療后無(wú)進(jìn)展生存期并無(wú)明顯差異。晚期NSCLC血液中循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)濃度和最大突變豐度均與M1b期有顯著相關(guān)性(P=0.007和0.028)。結(jié)論:晚期NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中基因突變狀態(tài)相似,血液ctDNA基因突變可以反映原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中部分基因突變差異。晚期NSCLC原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和血液ctDNA的任一基因檢測(cè)結(jié)果都可用來(lái)指導(dǎo)靶向治療。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2
【部分圖文】：

圖 1 NGS 在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)小標(biāo)本基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究流程圖ig. 1 Flow chart of NGS for genotyping of small biopsy of lymph node metastNA, endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, 支氣氣管針吸活檢; NGS, next-generation sequencing, 第二代測(cè)序技術(shù)2 結(jié)果資料究共入組 115 例高度懷疑 NSCLC 非鱗癌的患者，85 例明非鱗癌的患者納入分析，研究入選流程見(jiàn)圖 1-1。在 85 例患者中本無(wú)法滿足傳統(tǒng)基因檢測(cè)，在剩余 80 例進(jìn)行傳統(tǒng)基因檢測(cè)的患后，2 個(gè)標(biāo)本由于腫瘤細(xì)胞較少而無(wú)法滿足 NGS。在剩余 78 因 DNA 量提取較少未能進(jìn)行 NGS，最終 77(90.6%)例患者成功測(cè)和 NGS。其中，64(83.1%)例患者為肺腺癌，13(16.9%)例患者為3(16.9%)例患者為 IIIA 期, 8(10.4%)例患者為 IIIB 期, 56(72.7%

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文IV 期。77 例患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征見(jiàn)表 1-1。77 例患者成功進(jìn)行了傳統(tǒng)基因檢測(cè)和 NGS，其淋巴結(jié)特征見(jiàn)表 1-2。淋巴結(jié)短徑和長(zhǎng)徑平均大小分別 14.9 mm 和 22.2 mm，每個(gè)淋巴結(jié)平均穿刺次數(shù)為 5.2（3~8）次，35(45.5%)個(gè)淋巴結(jié)穿刺次數(shù)多于 5 次，42(54.5%)個(gè)淋巴結(jié)穿刺次數(shù)少于或等于 5 次。71 (93.4%)個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了 IHC 分型，包括 CK、TTF-1、P40 和CD56；平均 DNA 提取量為 1.48 1.67μg。

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2 NGS 和傳統(tǒng)方法基因檢測(cè)一致性我們通過(guò)將 NGS 對(duì)三個(gè)代表性基因 EGFR、ALK 和 ROS1 基因突變檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果比較，從而評(píng)價(jià) NGS 的檢測(cè)效能。在 77 個(gè)標(biāo)本中共檢測(cè)出基因突變 41 個(gè)，包括 32 個(gè) EGFR 基因突變、8 個(gè) ALK 基因融合和 1 個(gè) ROS1基因融合，這些突變均被傳統(tǒng)方法和 NGS 檢測(cè)出來(lái)（圖 1-2）。此外，NGS 檢測(cè)出 4 個(gè)額外的 EGFR 基因突變（圖 1-2 和圖 1-3A），由于傳統(tǒng)方法中基于 ARMS-PCR 技術(shù)的 EGFR 基因檢測(cè)試劑盒不包含這 4 個(gè)基因突變位點(diǎn)，從而未被檢測(cè)出來(lái)；其中 2 個(gè)患者接受了靶向藥物厄洛替尼治療，均達(dá)到了疾病穩(wěn)定狀態(tài)，截止隨訪日期分別獲得了 5 個(gè)月和 3 個(gè)月的 PFS，證明了 NGS 能夠提供基因突變的全貌從而最大程度地使患者接受合適的治療�？傊�，以傳統(tǒng)方法基因檢測(cè)為參考，NGS 與傳統(tǒng)方法一致性達(dá)到 100%。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 Kehua Wu;R Stephanie Huang;Larry House;William Chi Cho;南娟;;肺癌的下一代測(cè)序技術(shù)[J];中國(guó)肺癌雜志;2014年01期

2 魏軍;趙志軍;;下一代測(cè)序技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用[J];分子診斷與治療雜志;2013年03期

3 孫加源;韓寶惠;張儉;趙珩;戚大江;沈潔;顧愛(ài)琴;;超聲支氣管鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢對(duì)肺癌的診斷價(jià)值[J];中國(guó)肺癌雜志;2010年05期

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本文編號(hào)：2816809