近20年,奶牛遺傳改良使奶牛產(chǎn)奶量得到顯著提高,但奶牛感染各種病原微生物的風(fēng)險(xiǎn)卻在增加。由乳房炎和子宮炎癥等疾病造成的奶牛繁殖性能下降和生產(chǎn)壽命縮短,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。奶牛天然免疫力是應(yīng)對(duì)各種病原微生物感染的第一道防線(xiàn),通過(guò)遺傳途徑提高奶牛天然免疫力有助于提高其整體抵抗各種病原微生物感染的能力。全基因組差異基因表達(dá)分析技術(shù)的廣泛應(yīng)用,為了解奶牛天然免疫應(yīng)答機(jī)制提供了幫助。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)芯片技術(shù)及全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association studies,GWAS)為鑒定可用于提高奶牛天然免疫力的有效分子標(biāo)記和基因提供了有力的技術(shù)支撐。本研究綜合分析高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)中公布的奶牛乳房感染病原微生物前后差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道的不同國(guó)家奶牛群體乳房炎GWAS研究結(jié)果,篩選與奶牛乳房炎相關(guān)的天然免疫候選基因及其信號(hào)通路,并在細(xì)胞和分子水平對(duì)重要候選基因的功能及其遺傳變異效應(yīng)進(jìn)行了初步研究。1.奶牛乳房炎相關(guān)天然免疫候選基因主要利用Ingenuity?通路分析技術(shù)對(duì)公開(kāi)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析獲得。(1)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中奶牛乳房感染大腸桿菌(E.coli)和乳房鏈球菌(S.uberis)前后差異表達(dá)基因分析,找到505個(gè)表達(dá)變化趨勢(shì)一致的基因。對(duì)這505個(gè)基因進(jìn)行功能、信號(hào)通路及基因網(wǎng)絡(luò)互作分析,獲得奶牛乳房應(yīng)答不同病原微生物感染的共同機(jī)制。結(jié)果表明不同病原微生物感染乳腺均能引起的組織內(nèi)生理變化主要是細(xì)胞增殖能力變強(qiáng),凋亡被抑制,白細(xì)胞移動(dòng)增強(qiáng)。信號(hào)通路方面,IL-6信號(hào)通路在放大炎癥信號(hào)過(guò)程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用,IL-10和糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)通路在抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮基礎(chǔ)作用,白細(xì)胞依賴(lài)4條信號(hào)通路(Granulocyte Adhesion and Diapedesis、Agranulocyte Adhesion and Diapedesis、Leukocyte Extravasation Signaling、fMLP Signaling in Neutrophils)完成對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附與滲出�；蚧プ骶W(wǎng)絡(luò)分析顯示參與細(xì)胞存活和移動(dòng)的基因之間存在顯著的相互作用;(2)整理文獻(xiàn)報(bào)道的7個(gè)國(guó)家奶牛乳房炎或體細(xì)胞評(píng)分(SCS)關(guān)聯(lián)的GWAS研究,獲得93個(gè)候選SNP分子標(biāo)記,對(duì)這些標(biāo)記2Mb范圍內(nèi)的1635個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行信號(hào)通路分析,其中182個(gè)基因與32條信號(hào)通路顯著相關(guān),這些通路大多與免疫、乳房健康及形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些通路中有9個(gè)基因是距離相應(yīng)候選SNP最近的基因,分別是XCL1,PPP3CA,NFATC2,PRKAA1,HSF1,CSTF1,UGT2A3,CYP4F2,MAOA。(3)比較發(fā)現(xiàn),候選SNP分子標(biāo)記附近基因(1635個(gè)基因)中有48個(gè)基因在乳腺感染E.coli或S.uberis時(shí)表達(dá)發(fā)生變化(出現(xiàn)在505個(gè)基因中)。對(duì)這48個(gè)基因進(jìn)行信號(hào)通路和基因網(wǎng)絡(luò)互作分析,有11個(gè)基因顯著影響白細(xì)胞滲出與粘附等5條信號(hào)通路“Granulocyte Adhesion and Diapedesis”、“Agranulocyte Adhesion and Diapedesis”、“Role of IL-17A in Psoriasis”、“Ephrin Receptor Signalling”和“Stearate Biosynthesis I(Animals)”。有16個(gè)介導(dǎo)組織存活(Organismal Survival)和細(xì)胞移動(dòng)(Cellular Movemen)的基因之間有顯著的相互作用;(4)綜合基因在天然免疫反應(yīng)中的作用及其在不同病原微生物感染奶牛乳房組織時(shí)的表達(dá)變化,同時(shí)考慮這些基因在染色體上與奶牛乳房炎顯著關(guān)聯(lián)SNP的距離,最終篩選得到17個(gè)參與白細(xì)胞滲出、炎癥調(diào)控及乳房形態(tài)結(jié)構(gòu)和健康的天然免疫候選基因(SELP,SELL,CXCL2,CXCL6,CXCL8,XCL1,ACTR3,BCAR1,FABP4,FASN,GNAS,SORBS1,HSF1,PPP3CA,NFATC2,PRKAA1,CYP4F2)。2.利用LPS刺激奶牛白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型在體外初步研究了炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)牛SELP和SELL的作用以及炎癥信號(hào)引起的白細(xì)胞凋亡抑制作用。(1)牛SELP和SELL都參與了白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附。LPS引起的牛白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的快速粘附增強(qiáng)反應(yīng)依賴(lài)SELP。SELL與配體作用能激活白細(xì)胞增強(qiáng)其粘附能力;(2)牛血管內(nèi)皮細(xì)胞主要粘附基因SELP,SELE,ICAM1,VCAM1表達(dá)在LPS刺激時(shí)顯著上升,而白細(xì)胞中關(guān)鍵粘附基因CXCR2,PSGL-1表達(dá)在LPS刺激時(shí)下降,SELL基因表達(dá)在LPS刺激時(shí)變化不顯著;(3)外周血顆粒白細(xì)胞自發(fā)凋亡在LPS刺激時(shí)下降,而無(wú)顆粒白細(xì)胞自發(fā)凋亡不受LPS刺激影響。白細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)基因BCL2,BCL2A1,SGK1表達(dá)在LPS刺激時(shí)顯著上升,可能是導(dǎo)致顆粒白細(xì)胞凋亡抑制的原因。3.對(duì)SELP,SELL以及SELE三個(gè)選擇素家族基因外顯子及側(cè)翼區(qū)域多態(tài)性鑒定分型,并與奶牛疾病、繁殖、產(chǎn)奶和生產(chǎn)壽命等性狀關(guān)聯(lián)分析。(1)在SELP基因外顯子發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP,其中3個(gè)位錯(cuò)義突變(引起氨基酸改變),SELL基因外顯子上找到3個(gè)SNP,均為同義突變(不引起氨基酸改變),SELE基因外顯子上找到1個(gè)SNP,為同義突變;(2)對(duì)SELP基因上5個(gè)SNP位點(diǎn)(SELPE4,SELPE5,SELPE6,SELPE8,SELPE13)、SELL上2個(gè)SNP位點(diǎn)(SELLE3,SELLE4)和SELE基因上1個(gè)SNP位點(diǎn)(SELEE14)以及SELP基因下游一個(gè)SNP位點(diǎn)rs41579632(報(bào)道與奶牛SCS顯著關(guān)聯(lián))共9個(gè)SNP標(biāo)記,在337頭荷斯坦奶牛樣本中進(jìn)行分型。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)分別位于SELP,SELL和SELE三個(gè)基因上的位點(diǎn)SELPE13,SELLE4,SELEE14之間呈一定程度連鎖不平衡(r2在0.31-0.80之間)。SELP基因內(nèi)SNP位點(diǎn)SELPE4和SELPE5完全連鎖,并與SELPE6存在連鎖不平衡(r2=0.5)。SELP,SELL,SELE三個(gè)基因上所有位點(diǎn)與rs41579632都不存在連鎖不平衡(r20.1);(3)9個(gè)SNP位點(diǎn)分別與奶牛第二個(gè)泌乳期100天內(nèi)患乳房炎和子宮疾病(子宮炎或子宮內(nèi)膜炎)風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)SELLE3與子宮炎癥疾病患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),AA基因型奶�；疾★L(fēng)險(xiǎn)顯著小于其它兩種基因型奶牛;(4)9個(gè)SNP位點(diǎn)分別與奶牛繁殖性狀(初配年齡、初懷年齡、配種間隔、空懷時(shí)間、產(chǎn)犢年齡、配種次數(shù)、產(chǎn)犢間隔)關(guān)聯(lián)分析。SELPE6與奶牛初懷所需配種次數(shù)、第一和第二胎產(chǎn)犢年齡、第一胎產(chǎn)犢間隔顯著關(guān)聯(lián),GG型奶牛表現(xiàn)較優(yōu)。SELPE8與奶牛初配年齡、初懷年齡、第一和第二胎產(chǎn)犢年齡均顯著關(guān)聯(lián),GG型奶牛個(gè)體表現(xiàn)較優(yōu);SELPE13與SELLE4、SELEE14三個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型組合與第二胎配種次數(shù)顯著關(guān)聯(lián),H1H1單倍型組合為優(yōu)勢(shì)組合;(5)9個(gè)SNP位點(diǎn)分別與產(chǎn)奶性狀(泌乳天數(shù)、305天奶量、乳脂率、乳蛋白率)關(guān)聯(lián)分析,標(biāo)記SELPE6與第一胎泌乳天數(shù)、第二胎305天奶量顯著關(guān)聯(lián),AG型奶牛表現(xiàn)較優(yōu)。SELPE13與第一胎乳脂率顯著關(guān)聯(lián),AT基因型奶牛表現(xiàn)較優(yōu)。SELEE14與第二胎305天奶量顯著關(guān)聯(lián),CG型奶牛表現(xiàn)較優(yōu),標(biāo)記rs41579632與第一胎乳脂率顯著關(guān)聯(lián),AA型、AG型奶牛表現(xiàn)較優(yōu);(6)9個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因型奶牛生產(chǎn)壽命進(jìn)行分析,SELPE 5與奶牛生產(chǎn)壽命顯著關(guān)聯(lián),AA型奶牛生產(chǎn)壽命顯著低于AC和CC型奶牛。4.對(duì)奶牛重要天然免疫相關(guān)基因RelA和TREM1基因的外顯子及側(cè)翼區(qū)域多態(tài)性鑒定分型,并與奶牛疾病、繁殖、產(chǎn)奶和生產(chǎn)壽命等性狀關(guān)聯(lián)分析。(1)RelA基因外顯子區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn),在第5內(nèi)含子內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)RelA-intron5。TREM1基因外顯子發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)TREM-SP和TREM-3UTR,分別位于外顯子剪接區(qū)和3’UTR區(qū);(2)RelA-intron5與奶牛生產(chǎn)壽命、第一胎乳脂率及乳蛋白率、初產(chǎn)年齡、第一胎產(chǎn)犢間隔等多個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián),CC型奶牛表現(xiàn)較優(yōu)。TREM-SP與本研究所有性狀均無(wú)相關(guān)性,TREM-3UTR與奶牛生產(chǎn)壽命相關(guān),AA型奶牛平均壽命顯著低于另外兩種基因型奶牛。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類(lèi)】：S858.23
【部分圖文】：

-1 大腸桿菌（A）或金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清（B）激活牛乳腺上皮細(xì)胞主要（Gilbert et al 2013）. 1-1 Main signaling pathways supposed to be activated in MEC exposed to eithcrude LPS (A) or S. aureus culture supernatant (B). (Gilbert et al 2013)牛乳房天然免疫應(yīng)答分子機(jī)制（基于基因差異表達(dá)研究）達(dá)譜芯片和高通量測(cè)序技術(shù)以及差異表達(dá)基因（Differential express分析技術(shù)的發(fā)展，為深入了解乳腺應(yīng)對(duì)不同病原菌的應(yīng)答機(jī)制提供前，大量乳房感染相關(guān)的基因差異表達(dá)高通量數(shù)據(jù)公布，為人們了應(yīng)答分子機(jī)制提供了幫助。房組織為研究對(duì)象itenhuis 等人(2011)對(duì)產(chǎn)后 4-6 周的健康丹麥荷斯坦奶牛人工感染 Eli 引起的乳腺局部基因差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)感染 24 小時(shí)乳腺中上調(diào) 699

23圖 2-1. 白細(xì)胞粘附與滲出信號(hào)通路Figure. 2-1. Granulocyte adhesion and diapedesis signaling紅色表示感染引起的基因表達(dá)上調(diào)，綠色表示感染引起的基因表達(dá)下調(diào)。Red denotes gene up-regulation and green denotes gene down-regulation by infection.

i 和 S. uberis 感染奶牛乳房顯著相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)作網(wǎng)絡(luò)反映了不同信號(hào)通路之間的相互影響以及基因在不同基因一共構(gòu)建了 25 個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)，其中 Network 3（圖 2-2）與涉及的功能包括心血管疾�。–ardiovascular Disease），血液atological System Development and Function），免疫細(xì)胞販運(yùn)（。 在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，趨化因子處于中心位置發(fā)揮直接作用，引炎癥部位移動(dòng)。從表達(dá)數(shù)據(jù)看，趨化因子上調(diào)倍數(shù)都非常大. coli 感染時(shí)上調(diào)了 82.99 倍（附表 1）。免疫細(xì)胞滲出越劇烈FKBIA 作為炎癥抑制因子對(duì)該網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮著核心調(diào)節(jié)作用，將圍內(nèi)，避免對(duì)機(jī)體造成不可修復(fù)的損傷。但是在該網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)子上調(diào)的因子，這說(shuō)明兩種細(xì)菌在啟動(dòng)免疫細(xì)胞移動(dòng)的上游

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張敏;FABP3對(duì)LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控及機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2817043