自交不親和反應(yīng)是高等植物進(jìn)化出的一種阻止自花授粉、促進(jìn)異花授粉的繁殖機(jī)制,有利于防止自交衰退,在育種及遺傳上具有重要的研究價值。近年,甘藍(lán)型油菜自交不親和反應(yīng)分子機(jī)制的研究取得了較大突破,然而其下游信號傳導(dǎo)因子的鑒定仍非常有限。本研究以甘藍(lán)型油菜Westar及擬南芥Col-0生態(tài)型為材料,利用序列分析、遺傳轉(zhuǎn)化、表達(dá)分析、酵母雙雜交、轉(zhuǎn)錄組測序等手段,通過對親和及不親和反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑的研究,成功鑒定甘藍(lán)型油菜自交不親和反應(yīng)正調(diào)控因子Bn CIMS1(Cobalamin-Independent Methionine Synthase 1),為自交不親和反應(yīng)分子機(jī)制的研究提供了新的思路;同時證明了At CIMS1在擬南芥自交不親和反應(yīng)中具有保守功能,為探索擬南芥屬植物與蕓薹屬植物間自交不親和系統(tǒng)的保守性提供新的證據(jù)。取得結(jié)果如下:1.Bn CIMS1在甘藍(lán)型油菜自交不親和反應(yīng)中的作用經(jīng)共線性和進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)CIMS1及其同源基因CIMS2的基因組序列和蛋白序列在十字花科物種中都是高度保守的。時空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),Bn CIMS1在甘藍(lán)型油菜Westar柱頭和莖的表達(dá)量最高,在其它部位表達(dá)量相對較低。Bn CIMS2在Westar各部位中表達(dá)量極低,在柱頭中幾乎不表達(dá)。在甘藍(lán)型油菜Westar柱頭中通過RNAi技術(shù)下調(diào)Bn CIMS1的表達(dá),可部分打破甘藍(lán)型油菜的自交不親和性,說明Bn CIMS1是自交不親和反應(yīng)的正調(diào)控因子。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Bn CIMS1主要在胞質(zhì)中表達(dá)。通過酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證Bn CIMS1與自交不親和反應(yīng)相關(guān)基因Bn SRK-1及Bn ARC1間的相互作用關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Bn CIMS1與兩個基因間均無互作關(guān)系,說明Bn CIMS1以一種新的未知途徑調(diào)控自交不親和反應(yīng)。2.轉(zhuǎn)基因自交不親和擬南芥的創(chuàng)建及CIMS1功能保守性分析將自交不親和A.halleri最顯性的S13單倍型Ah SRK13和Ah SCR13以及自交不親和相關(guān)基因Ah ARC1共同轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0生態(tài)型中,成功得到部分轉(zhuǎn)基因自交不親和擬南芥,而只轉(zhuǎn)入Ah SRK13和Ah SCR13的轉(zhuǎn)基因株系全部表現(xiàn)為自交親和。說明ARC1確實(shí)為自交不親和反應(yīng)所必須。為驗(yàn)證At CIMS1和At CIMS2在擬南芥自交不親和反應(yīng)中是否具有保守功能,分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因自交不親和擬南芥與cims1、cims2 T-DNA插入突變體的雜種F1,篩選純合突變體背景的F2轉(zhuǎn)基因株系,各單株均為自交親和,證明At CIMS1和At CIMS2都在維持?jǐn)M南芥自交不親和反應(yīng)中起作用,且CIMS1在甘藍(lán)型油菜和擬南芥自交不親和反應(yīng)調(diào)控中具有保守功能。3.BC等其它自交不親和反應(yīng)候選基因的功能研究⑴BC的下調(diào)導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜和擬南芥葉片發(fā)育異常分別在甘藍(lán)型油菜Westar和擬南芥Col-0中下調(diào)BC(Biotin carboxylase)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因Bn BC RNAi Westar株系和At BC RNAi Col-0株系葉片發(fā)育異常,主要表現(xiàn)為葉片皺縮,且轉(zhuǎn)基因At BC RNAi Col-0株系柱頭對花粉粘附力下降。⑵SLR1啟動子的特異性分析克隆甘藍(lán)型油菜Westar SLR1基因啟動子,并連接GUS報告基因,轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0中。通過GUS染色分析SLR1啟動子特異性,發(fā)現(xiàn)SLR1啟動子在開花當(dāng)天的雌蕊柱頭特異表達(dá),同時在幼苗期除子葉外其它部位及成熟葉片中均有表達(dá)。證明SLR1啟動子在擬南芥中并非柱頭特異啟動子。⑶ANN1等三個候選基因的功能研究在甘藍(lán)型油菜Westar柱頭中特異下調(diào)自交不親和反應(yīng)候選基因ANN1(膜聯(lián)蛋白基因)、FBA2(果糖二磷酸醛縮酶基因)以及MUR5(可逆的磷酸化多肽)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)三個基因分別被干涉后不能影響甘藍(lán)型油菜的自交親和性,且在轉(zhuǎn)基因植株中未觀察到其它表型變化。4.轉(zhuǎn)錄組分析親和/不親和反應(yīng)基因表達(dá)的時相變化對甘藍(lán)型油菜親和及不親和授粉后不同時間點(diǎn)的柱頭進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。根據(jù)差異表達(dá)基因的分布情況,將授粉事件分為早期授粉事件和晚期授粉事件,并發(fā)現(xiàn)自交不親和反應(yīng)信號傳導(dǎo)路徑比親和反應(yīng)更復(fù)雜。通過對差異表達(dá)基因的功能注釋,提出了一些可能調(diào)控花粉-柱頭互作機(jī)制的假設(shè)。根據(jù)對柱頭富集表達(dá)基因的代謝途徑的注釋,發(fā)現(xiàn)SAM循環(huán)中所有基因都在柱頭中高表達(dá),包括本文已驗(yàn)證的自交不親和反應(yīng)正調(diào)控因子BnCIMS1。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S565.4
【部分圖文】：

8圖 1.1 蕓薹屬植物自交不親和反應(yīng)信號傳導(dǎo)模式（Yamamoto and Nishio 2014）(A) 蕓薹屬自交不親和反應(yīng) SRK-ARC1-Exo70A1 信號傳導(dǎo)途徑。(B) 自交不親和反應(yīng) SRK-ARC1-GLO1 信號傳導(dǎo)途徑。Fig. 1.1 Models of the identified self-incompatibility signaling pathways in Brassica (Yamamoto and Nishio 2014)(A) The self-incompatibility signaling pathway mediated by SRK-ARC1-Exo70A1 in Brassica. (B) Tself-incompatibility signaling pathway mediated by SRK-ARC1-GLO1.

柱頭乳突細(xì)胞結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，授粉后白菜柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架會發(fā)生變化（圖1.2）（Iwano et al 2007）。給白菜授以親和花粉，或者用親和花粉外被處理柱頭時，引發(fā)柱頭乳突細(xì)胞頂端肌動蛋白聚合現(xiàn)象，致使花粉水合過程中頂端區(qū)域肌動蛋白束增加。這一發(fā)現(xiàn)剛好解釋了分泌囊泡沿肌動蛋白骨架向柱頭與花粉接觸位點(diǎn)運(yùn)輸，促進(jìn)囊泡的聚集和膜融合（He and Guo, 2009）。在授親和花粉的柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)可觀察到大型中心液泡和管狀液泡向花粉接觸點(diǎn)移動，推測這一現(xiàn)象是將花粉水合所需的水分及物質(zhì)運(yùn)送到花粉細(xì)胞。而對白菜柱頭授不親和花粉或以不親和外被提取物處理時，柱頭乳突細(xì)胞頂端微絲數(shù)量減少，且管狀液泡呈現(xiàn)不規(guī)則排列（Iwano etal 2007）。

圖 1.3 三系法生產(chǎn)甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種模式圖（傅廷棟 19 production modle of triple-cross hybrid using B. napus self-incompTingdong 1995)jana and Nasrallah（2015）將 SRK 及其對應(yīng) S 單倍型的 SCR胞中共表達(dá)，理論上可以實(shí)現(xiàn)自交不親和反應(yīng)在柱頭細(xì)胞柱頭乳突細(xì)胞中表達(dá)的 SCR/SP11 并不能像來源于花粉外壁K 介導(dǎo)的自交不親和反應(yīng)，相反地，卻抑制了 SRK 的活性表達(dá)的 SCR/SP11 與其受體 SRK 在柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)相互作中，而不能轉(zhuǎn)移到柱頭乳突細(xì)胞膜上，阻礙了 SRK 的跨膜CR/SP11 的互作，因而不能產(chǎn)生自交不親和反應(yīng)信號，阻遞。這一現(xiàn)象類似于在多細(xì)胞動物中發(fā)現(xiàn)的將跨膜蛋白作徑，被叫做配體介導(dǎo)的順式抑制作用（ligand-mediated

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊紅花;秦宏偉;;植物自交不親和機(jī)制的研究進(jìn)展[J];泰山學(xué)院學(xué)報;2009年03期

2 陳超,李保國,齊國輝,鈕力亞,蘇智海;果樹自交不親和機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];河北林果研究;2005年01期

3 劉豫東;曾靜;高啟國;;蕓薹屬自交不親和信號傳導(dǎo)功能分子的研究進(jìn)展[J];南方農(nóng)業(yè);2012年06期

4 華志明;植物自交不親和分子機(jī)理研究的一些進(jìn)展[J];植物生理學(xué)通訊;1999年01期

5 楊谷良,譚曉風(fēng),烏云塔娜;配子體自交不親和植物花粉S基因研究進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2005年10期

6 牛義;王志敏;湯青林;宋明;朱利泉;王小佳;;甘藍(lán)自交不親和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能基因研究進(jìn)展[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報;2006年05期

7 白生文;范惠玲;;自交不親和植物自交親和性研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年09期

8 何余堂,涂金星,傅廷棟,陳寶元;蕓薹屬自交不親和基因的分子生物學(xué)及進(jìn)化模式[J];植物學(xué)通報;2003年05期

9 陳莫;張薇;胡彥如;謝世清;楊生超;;植物孢子體型自交不親和的分子研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2017年10期

10 黃紹西;彭宏祥;朱建華;陳香玲;徐寧;;沙田柚雌蕊自交不親和基因之間的調(diào)控機(jī)理研究[J];中國園藝文摘;2013年11期

相關(guān)會議論文 前8條

1 烏云塔娜;譚曉風(fēng);;中國白梨自交不親和基因的分離鑒定及品種S基因型的確定[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

2 廉小平;王玉奎;白曉t

本文編號：2814570