目的:胰腺癌的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,預(yù)后極差。遺憾的是,至今尚未明確胰腺癌發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。胰蛋白酶原基因(Protease Serine 1,PRSS1),突變可以引發(fā)慢性胰腺炎,并且先前研究在胰腺癌患者的外周血中也發(fā)現(xiàn)存在PRSS1突變,但迄今尚未解答PRSS1突變是否是胰腺癌的原發(fā)因素。因此,本研究將通過直接測(cè)序法檢測(cè)胰腺癌患者的外周血中PRSS1突變的頻率,構(gòu)建人源突變型胰蛋白酶原基因(PRSS1_p.Thr137Met)敲入小鼠模型(transgenic mice,mt PRSS1),驗(yàn)證突變型胰蛋白酶與胰腺癌之間的關(guān)系,并探索其可能的發(fā)病機(jī)制。方法:(1)抽提80例胰腺導(dǎo)管癌患者與220例正常對(duì)照的全血DNA,PCR擴(kuò)增之后,直接測(cè)序分析,對(duì)突變與多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行定位并分析突變類型;(2)免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)分析PRSS1突變的胰腺癌組織;(3)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得人源突變型基因敲入(mt PRSS1)小鼠,繁殖擴(kuò)群,子代小鼠基因型鑒定;(4)mt PRSS1小鼠與野生型(Wild type,WT)小鼠用血生化檢測(cè)、組織HE染色、免疫組化、免疫熒光、膠原染色和網(wǎng)纖染色分析小鼠的表型差異;(5)選取同窩8周齡3只mt PRSS1小鼠和3只WT小鼠,取其胰腺組織抽提RNA做q RT-PCR和Western blot對(duì)可能的通路蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:(1)在胰腺癌患者中,發(fā)現(xiàn)4例攜帶PRSS1_p.Thr137Met突變、1例攜帶PRSS1_p.Gln56*突變(為新發(fā)現(xiàn)的突變形式,終止密碼提前出現(xiàn),產(chǎn)生截?cái)嗟鞍?、1例攜帶PRSS1_p.Asp162Asp突變,而這些變異形式均未發(fā)現(xiàn)于220例正常對(duì)照中。(2)免疫組織化學(xué)顯示,胰腺癌組織胰蛋白酶表達(dá)顯著高于癌旁組織;(3)人源突變型PRSS1基因敲入小鼠模型(mt PRSS1)成功構(gòu)建,子代(F1~F6)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好;子代小鼠可鑒定出突變型和野生型兩種基因型,且比例符合孟德爾定律。(4)mt PRSS1小鼠血脂肪酶(lipase,LIPA)(mt PRSS1:441±69.376 U/L;WT:260±8U/L;P=0.0109)、淀粉酶(amylase,AMY)(mt PRSS1:1953.333±298.719U/L;WT:1073.333±16.073 U/L;P=0.0073)及血糖(mt PRSS1:15.433±1.464 mmol/L;WT:4.933±0.757 mmol/L;P=0.0004)明顯高于正常小鼠水平。(5)組織病理顯示mt PRSS1小鼠相對(duì)于同一窩野生型小鼠出現(xiàn)胰腺小導(dǎo)管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的異型性,導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列紊亂、粘液化生,上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia,Pan IN)。(6)Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)mt PRSS1小鼠的DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本(DNA Damage Inducible Transcript,DDIT4)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3,PI3K)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metallopeptidase,MMP)(MMP1,MMP8和MMP9)表達(dá)均高于WT小鼠,抑癌基因(Tumor Protein p53,p53)表達(dá)低于WT小鼠。(7)q RT-PCR分析表明,mt PRSS1小鼠胰腺組織中信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STAT)(STAT5A和STAT6)、酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK)(JAK1和JAK2)表達(dá)量均升高。結(jié)論:(1)胰腺癌患者的外周血中存在PRSS1基因突變,其中PRSS1_p.Thr137Met為相對(duì)高頻突變(5%)。(2)mt PRSS1小鼠與人類胰腺癌早期改變存在著相似的變化,PRSS1_p.Thr137Met突變可引發(fā)胰腺一些胰腺損傷、炎癥和腫瘤指標(biāo)的改變。(3)PRSS1_p.Thr137Met突變導(dǎo)致DDIT4高表達(dá),還可能同時(shí)激活PI3K-Akt與JAK-STAT兩條信號(hào)通路導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生,通過MMPs發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.9
【部分圖文】：

圖 1.1 PRSS1 基因的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件PCR 進(jìn)行 35 次循環(huán)獲得 PCR 產(chǎn)物，-20℃保存。.7.5 PCR 產(chǎn)物純化及測(cè)序吸取PCR產(chǎn)物20μl直接送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司純化及測(cè)序，并結(jié)果在NCBI上與標(biāo)準(zhǔn)序列（NCBI Reference Sequence: NG_008307.3）進(jìn)行對(duì)，確認(rèn)突變的存在。 結(jié)果.1 胰腺癌患者影像資料與胰腺腫瘤組織H&E染色

部分疑似胰腺癌患者影像

18圖1.3 部分患者胰腺腫瘤組織(H&E x200)（A）高分化腺癌； （B）中分化腺癌；（C）中-低分化腺癌；（D）低分化腺癌確診為胰腺癌，部分患者的病理組織 HE 切片分別呈不同分化的腺癌（圖1.3）。1.3.2 胰腺癌患者胰腺組織免疫組化免疫組化結(jié)果提示，在胰腺正常組織中，胰蛋白酶原表達(dá)陰性；在胰腺癌組織和癌旁組織中，表達(dá)為陽性。圖1.4 胰腺癌組織中高表達(dá)胰蛋白酶原(IHC x200)（A）正常胰腺組織；（B）胰腺癌組織；（C）胰腺癌旁組織1.3.3 PRSS1 基因相對(duì)應(yīng)的引物 PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖 1.5）PCR 產(chǎn)物條帶清晰，但較預(yù)計(jì)目標(biāo)產(chǎn)物位置稍顯滯后，是否與染料結(jié)合之后影響分子量有關(guān)？我們將 PCR 產(chǎn)物直接送往鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與 NCBI 標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2814029