[目的]研究非化療組和化療組不同亞型乳腺癌組織中FANCF相關(guān)基因mRNA的表達情況,尋找與乳腺癌密切相關(guān)的FA通路基因;在此基礎(chǔ)上進一步研究順鉑耐藥的癌組織中FANCF的表達情況;通過建立三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231順鉑耐藥細胞模型,驗證FANCF耐藥前后的差異表達,并通過RNAi干擾技術(shù)敲低FANCF的表達,探討FANCF在乳腺癌順鉑耐藥中的作用及其機制。[方法]收集手術(shù)切除的女性乳腺癌患者乳腺癌組織和正常乳腺組織標本共93例,其中非化療組的三陰型乳腺癌、Luminal型乳腺癌、HER2陽性型乳腺癌各20例,化療組相對應(yīng)的三型乳腺癌分別為11、13和9例。采用實時熒光定量RT-PCR法檢測乳腺癌組織和正常乳腺組織中的FANCF相關(guān)基因FANCA、FANCD2、FANCF、FANCI、BRCA1和BRCA2 mRNA的表達水平。收集順鉑敏感和順鉑耐藥的乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶組織石蠟切片共27例,其中順鉑敏感14例、順鉑耐藥13例,采用免疫組化方法檢測FANCF在其中的表達。以體外藥物濃度遞增法建立三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231順鉑耐藥細胞模型。CCK8法檢測細胞的順鉑抑制活性，實時熒光定量RT-PCR法檢測誘導(dǎo)順鉑耐藥前后FANCF的mRNA表達,Western blotting法驗證差異蛋白的表達。通過RNAi干擾技術(shù)敲低MDA-MB-231敏感細胞和順鉑耐藥細胞中FANCF的表達,在mRNA和蛋白水平進行敲低效果驗證。以CCK8法檢測順鉑對兩種細胞的IC50,流式細胞儀分析細胞凋亡的情況。[結(jié)果】1、FANCA、FANCF、FANCD2、FANCI、BRCA1 和 BRCA2 在 93 例非化療組和化療組患者組織樣本的mRNA表達:非化療組三陰型、Luminal型、HER2型乳腺癌組織中FANCF基因mRNA相對表達量均低于相應(yīng)正常乳腺組織(P0.01)，HER2 型乳腺癌組織中 BRCAI、BRCA2、FANCI 和 FANCD2 基因mRNA相對表達量高于對應(yīng)的正常乳腺組織且均高于三陰型和Luminal型乳腺癌組織中的mRNA表達量,三陰型乳腺癌組織中FANCD2和FANCI基因的mRNA相對表達量高于相應(yīng)的正常乳腺組織,Luminal型乳腺癌組織中FANCA基因mRNA表達量高于HER2型和三陰型(P0.05);化療組患者的組織樣本中三陰型乳腺癌組織中除FANCF外其余5個基因表達量均非常低,Luminal型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1、FANCI的表達均顯著高于正常乳腺組織,Luminal型乳腺癌患者BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因mRNA表達量均高于三陰型和HER2型(P均0.05);化療組三種亞型乳腺癌組織中FANCF的表達水平高于非化療組(P0.05)，且TNBC組差異最顯著,三陰型和HER2型乳腺癌組織的BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因mRNA表達量顯著低于對應(yīng)非化療組患者的乳腺癌組織的表達量(P0.05)；基因相關(guān)性分析結(jié)果顯示FANCF的表達與其余5個基因的表達水平呈現(xiàn)顯著負相關(guān),FANCA、FANCD2、FANCI、BRCA2、BRCA1 5個基因之間的表達水平呈顯著正相關(guān)。2、免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)FANCF在順鉑耐藥的乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶中的表達顯著高于順鉑敏感的乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織(P0.05)。3、體外順鉑濃度遞增法誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞順鉑耐藥3個月后的耐藥指數(shù)為13.5,GO/G1期細胞增多、S期和G2/M期細胞減少。在順鉑耐藥的乳腺癌細胞中FANCF的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(.P0.05)。4、使用 RNAi 干擾技術(shù)敲低 FANCF 后,MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/Pt 細胞凋亡增加、細胞對順鉑的藥物敏感性顯著升高,且以MDA-MB-231/Pt細胞明顯。[結(jié)論]1、FANCF基因在非化療組乳腺癌組織中相對表達量均低于相應(yīng)正常乳腺組織,而在化療組乳腺癌組織中FANCF基因mRNA的表達上調(diào),提示這與化療藥物的使用有一定關(guān)系;FANCF mRNA在非化療組和化療組乳腺癌組織中的表達存在差異,尤其在TNBC中的表達差異最為顯著;三種不同亞型乳腺癌組織中FANCF相關(guān)基因的表達差異性較大,新輔助化療可在一定程度上影響B(tài)RCA1、BRCA2.FANCD2.FANCI 的表達。2、FANCF在順鉑耐藥的乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織中的表達顯著增加,提示FANCF可能與乳腺癌順鉑耐藥有關(guān)。3、在三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231順鉑耐藥細胞模型中,順鉑耐藥細胞MDA-MB-231/Pt較敏感細胞MDA-MB-231中FANCF的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高,推測三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231順鉑耐藥性的產(chǎn)生可能與FANCF基因的表達上調(diào)有關(guān)。4、體外合成 FANCF-siRNA,敲低 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/Pt 細胞的FANCF后,細胞對順鉑的敏感性均增加,細胞凋亡率亦顯著增加,且以MDA-MB-231/Pt細胞更為明顯,提示FANCF可能通過抗凋亡的作用參與三陰型乳腺癌細胞MDA-MB-231順鉑耐藥的發(fā)生,FANCF有望成為乳腺癌順鉑耐藥的潛在治療靶點。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【部分圖文】：

相對表達水平進行分析。逡逑２．１非化療組的乳腺癌組織和正常乳腺組織中ＦＡＮＣＦ相關(guān)基因的ｍＲＮＡ表達逡逑如圖１所示，在非化療組患者的組織樣本中，三陰型、Ｌｕｍｉｎａｌ型、ＨＥＲ２型逡逑２６逡逑

圖２化療組癌組織和正常組織ＦＡＮＣＦ相關(guān)基因的ｍＲＮＡ表達逡逑

槿橄侔┳櫓嶝疲粒危茫葡喙鼗餉潁恚遙危簾澩銼冉希]3?如圖３所示，在化療組患者的乳腺癌組織樣本中，三種亞型乳腺癌組織中逡逑ＦＡＮＣＦ的表達水平高于非化療組（Ｐ＜０．０５），其中ＴＮＢＣ組差異最為顯著；化療逡逑組的三陰型乳腺癌組織中除ＦＡＮＣＦ外

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本文編號：2809757