研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈性疾病(CAD)的一個主要類型,主要是由動脈粥樣硬化斑塊破裂后堵塞冠脈血管導(dǎo)致冠狀動脈血流減少或中斷引起。現(xiàn)在的研究結(jié)果表明動脈粥樣硬化是由各種原因?qū)е碌难軆?nèi)皮損傷引起,其病理機(jī)制主要涉及機(jī)體代謝、細(xì)胞炎癥、自噬和衰老等多個過程。我們都知道,冠心病的發(fā)生受基因和環(huán)境等多種因素共同影響。GATA4是一種在心臟中大量表達(dá)的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,在心血管發(fā)育、自噬、衰老與機(jī)體代謝等方面扮演著非常重要的角色。在基因表達(dá)過程中,目的基因表達(dá)水平受啟動子的調(diào)控。由此,我們可推測GATA4基因啟動子序列變異在急性心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。目的:研究急性心肌梗死病人和健康對照人群中GATA4基因啟動子序列變異情況,針對變異序列構(gòu)建pGL3報告基因表達(dá)載體,通過檢測雙熒光素酶活性,對GATA4基因啟動子轉(zhuǎn)錄水平的改變進(jìn)行分析,通過凝膠遷移實驗發(fā)現(xiàn)蛋白與DNA結(jié)合情況及對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的影響,從而證實遺傳變異對基因表達(dá)水平的影響及GATA4基因突變與急性心肌梗死病理機(jī)制的關(guān)系。方法:1、本研究包括兩組研究對象,分別為急性心肌梗死病人組和健康對照組,其中急性心肌梗死病人組395例,健康對照人群397例,記錄并統(tǒng)計兩組人群臨床資料信息,分離外周血單個核細(xì)胞并對基因組DNA進(jìn)行提取。2、參照NCBI數(shù)據(jù)庫上人GATA4基因啟動子序列,設(shè)計、合成引物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的辦法擴(kuò)增GATA4基因啟動子目的片段,然后直接進(jìn)行基因測序,根據(jù)測序結(jié)果將GATA4基因啟動子序列變異位點統(tǒng)計并分析。3、將野生型目的基因片段和經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)攜帶GATA4基因啟動子序列變異位點的目的片段分別構(gòu)建到PMD19-T載體,提取質(zhì)粒,擴(kuò)增、酶切后連接PGL3-basic報告基因載體,采用內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK和PGL3-basic報告基因載體脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法,體外轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞及HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后檢測兩種細(xì)胞中雙熒光素酶活性,記錄并統(tǒng)計結(jié)果,初步探討GATA4基因啟動子序列變異對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。4、將含有GATA4基因啟動子變異位點的DNA序列設(shè)計成生物素標(biāo)記的探針,分別與HEK293細(xì)胞和H9c2細(xì)胞的核提取物進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),然后進(jìn)行凝膠遷移實驗(EMSA),轉(zhuǎn)膜后用化學(xué)發(fā)光法檢測生物素標(biāo)記的探針與核蛋白的結(jié)合情況,進(jìn)一步探討GATA4基因啟動子序列變異對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的影響。結(jié)果:1、通過基因測序,共發(fā)現(xiàn)14個DNA序列變異位點(DSVs),包括1個插入突變 g.31979-31980InsG 和 2 個 SNPs 位點:g.31360TC(rs372004083)和g.31437CA(rs769262495),在急性心肌梗死病人和正常對照組中均有出現(xiàn),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在急性心肌梗死病人組中發(fā)現(xiàn)的3個DSVs,分別為g.31806CT、g.31900GC和g.32241CT,而在健康對照組中并未發(fā)現(xiàn)。其中有 8 個 DSVs,分別為 g.31403GT、g.31492TA、g.31566GC、g.31567AG、g.31715CA、g.31730AG、g.32171AG 和 g.32190CT 僅存在與健康對照組中,在急性心肌梗死病人組中尚未發(fā)現(xiàn)。2、成功構(gòu)建含有GATA4基因啟動子野生型和序列變異位點的PGL3-basic 報告基因載體,分別為 PGL3-WT、PGL3-31403T、PGL3-31492A、PGL3-31566C、PGL3-31715A、PGL3-31730G、PGL3-31806T、PGL3-31900C和 PGL3-32241T。3、在體外瞬時轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中,僅在急性心肌梗死病人組中發(fā)現(xiàn)的DSVs能改變GATA4基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性:g.31806CT、g.31900GC和g.32241CT均能升高GATA4基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性(P0.01)。發(fā)現(xiàn)的其余DSVs均未能改變GATA4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。4、凝膠遷移實驗后經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞核提取物與DNA結(jié)合情況,g.31806CT和g.31900GC變異位點未見明顯特異性結(jié)合條帶,g.32241CT基因變異位點有特異性結(jié)合條帶,并且其WT與DSV結(jié)合情況有明顯差異。結(jié)論:在AMI病人中發(fā)現(xiàn)的GATA4基因啟動子序列變異位點可能會影響GATA4基因的轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,進(jìn)而影響基因表達(dá)水平,在AMI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,為AMI的病理機(jī)制、預(yù)防、診斷與治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R542.22
【部分圖文】：

圖１：上為ＧＡＴＡ４基因啟動子片段１邋（５１０ｂｐ），泳道１－１０為其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，逡逑泳道１１為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ條帶；下為ＧＡＴＡ４基因啟動子片段２邋（５６９ｂｐ），逡逑泳道１－１０為其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，泳道１１為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ條帶；均符合目的逡逑片段大小。逡逑ｇ．３１５６６Ｇ＞Ｃ邐ｇ．３１７３０Ａ＞Ｇ逡逑ｇ．３１４９２Ｔ＞Ａ邐ｇ．３１８０６Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．３１４３７Ｃ＞Ａ邐ｇ．３１９００Ｇ＞Ｃ邐ｇ．３２１９０Ｃ＞Ｔ逡逑ｇ．３１４０３Ｇ＞Ｔ邐ｇ．３１９７９＿８０ｌｎｓＧ邐ｇ．３２２４１Ｃ＞Ｔ逡逑＇邋１逡逑Ｉ邐ｉ邋＼ｔ邋ｉ邋ｉ邋＼邋Ｉ邋Ｉ邋１邐Ｉ邐？邋ｒ邐逡逑－１０００邐“邐－８００邐－６００邐１邐－４００邐－２００邐＋１邋Ｅｘ0ｎ１逡逑ｇ．３１３６０Ｔ＞Ｃ邐ｇ．３１５６７Ａ＞Ｇ邐ｇ．３１７１５Ｃ＞Ａ邐ｇ．３２１７１Ａ＞Ｇ逡逑

１邐２３４５６７８９邐１０邋１１逡逑圖１：上為ＧＡＴＡ４基因啟動子片段１邋（５１０ｂｐ），泳道１－１０為其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，逡逑泳道１１為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ條帶；下為ＧＡＴＡ４基因啟動子片段２邋（５６９ｂｐ），逡逑泳道１－１０為其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，泳道１１為Ｄ２０００邋Ｐｌｕｓ邋ｍａｒｋｅｒ條帶；均符合目的逡逑片段大小。逡逑

圖３：此為ＡＭＩ病人組中發(fā)現(xiàn)的ＤＳＶｓ測序色譜圖，這３個ＤＳＶｓ：邋ｇ．３１８０６Ｃ＞Ｔ，逡逑ｇ．３１９００Ｇ＞Ｃ和ｇ．３２２４１Ｃ＞Ｔ，上為野生型ＤＮＡ序列，下為雜合型ＤＮＡ序列，逡逑箭頭標(biāo)示為ＤＮＡ序列變異位點。逡逑

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本文編號：2809465