豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是全球流行的極具威脅性的豬病之一,由具有高致死率的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起。該病在世界各地的爆發(fā)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經濟損失,但迄今為止尚無有效安全的疫苗可用。因此,研制安全高效的PEDV疫苗具有十分重要的意義。S蛋白是PEDV的主要結構蛋白,由S1區(qū)和S2區(qū)組成,其中S1含有3個中和表位區(qū)域,常作為PEDV基因工程疫苗研究中最重要的一個靶蛋白。本研究利用MultiBac多基因表達系統(tǒng)構建含有不同S1基因拷貝數的重組桿狀病毒:AcMNPV-IM-p10S1、AcMNPV-IM-2p10S1、AcMNPV-IM-3p10S1、AcMNPV-IM-phS1、AcMNPV-IM-2phS1、AcMNPV-IM-3phS1、AcMNPV-IM-p10S1-phS1和AcMNPV-IM-2p10S1-2phS1,以實現S1蛋白在昆蟲細胞中的高效表達,并將純化后的S1蛋白作為基因工程疫苗使用,初步探索PEDV S1蛋白在BALB/c小鼠上的免疫效果。通過Western Blot和His標簽ELISA定量檢測試劑盒分析S1蛋白的表達情況,結果顯示不同拷貝數的重組桿狀病毒感染Sf9細胞后,S1蛋白均能有效表達,而且其蛋白表達量受到基因拷貝數和啟動子的影響。1.當S1基因由1拷貝增加到3拷貝時,表達量隨拷貝數的增加而增加,在3拷貝時表達量達到最高,4拷貝時有所下降。2.p10啟動子驅動的蛋白表達量要顯著高于polh啟動子驅動的蛋白表達量。將表達的S1蛋白經過鎳柱親和層析純化后與等量的佐劑混勻并乳化制備PEDV亞單位疫苗,然后將其背部皮下注射免疫小鼠。間接ELISA檢測S1蛋白刺激小鼠產生的血清抗體水平。結果表明S1蛋白可以誘導小鼠產生特異性免疫反應。本研究利用桿狀病毒多基因表達系統(tǒng)成功表達了PEDV S1蛋白,并利用多拷貝表達和替換啟動子摸索了提高蛋白表達量的方法,而且純化后的S1蛋白具有良好的免疫原性,為以后研發(fā)基于S1蛋白的PEDV基因工程疫苗提供有力的支持。
【學位單位】：南陽師范學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4

【參考文獻】

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本文編號：2811094