豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是全球流行的極具威脅性的豬病之一,由具有高致死率的豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起。該病在世界各地的爆發(fā)給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失,但迄今為止尚無有效安全的疫苗可用。因此,研制安全高效的PEDV疫苗具有十分重要的意義。S蛋白是PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,由S1區(qū)和S2區(qū)組成,其中S1含有3個(gè)中和表位區(qū)域,常作為PEDV基因工程疫苗研究中最重要的一個(gè)靶蛋白。本研究利用MultiBac多基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建含有不同S1基因拷貝數(shù)的重組桿狀病毒:AcMNPV-IM-p10S1、AcMNPV-IM-2p10S1、AcMNPV-IM-3p10S1、AcMNPV-IM-phS1、AcMNPV-IM-2phS1、AcMNPV-IM-3phS1、AcMNPV-IM-p10S1-phS1和AcMNPV-IM-2p10S1-2phS1,以實(shí)現(xiàn)S1蛋白在昆蟲細(xì)胞中的高效表達(dá),并將純化后的S1蛋白作為基因工程疫苗使用,初步探索PEDV S1蛋白在BALB/c小鼠上的免疫效果。通過Western Blot和His標(biāo)簽ELISA定量檢測(cè)試劑盒分析S1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示不同拷貝數(shù)的重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后,S1蛋白均能有效表達(dá),而且其蛋白表達(dá)量受到基因拷貝數(shù)和啟動(dòng)子的影響。1.當(dāng)S1基因由1拷貝增加到3拷貝時(shí),表達(dá)量隨拷貝數(shù)的增加而增加,在3拷貝時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,4拷貝時(shí)有所下降。2.p10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)量要顯著高于polh啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)量。將表達(dá)的S1蛋白經(jīng)過鎳柱親和層析純化后與等量的佐劑混勻并乳化制備PEDV亞單位疫苗,然后將其背部皮下注射免疫小鼠。間接ELISA檢測(cè)S1蛋白刺激小鼠產(chǎn)生的血清抗體水平。結(jié)果表明S1蛋白可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。本研究利用桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了PEDV S1蛋白,并利用多拷貝表達(dá)和替換啟動(dòng)子摸索了提高蛋白表達(dá)量的方法,而且純化后的S1蛋白具有良好的免疫原性,為以后研發(fā)基于S1蛋白的PEDV基因工程疫苗提供有力的支持。
【學(xué)位單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2811094