粘細菌是具有卓越次級代謝產物合成能力的革蘭氏陰性細菌,被認為是開發(fā)合成新藥物重要來源。纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)屬于堆囊菌亞目,它可以將自然界中的纖維素作為碳源來滿足自身的生長需求。由于其可以產生多種具有生物活性的次級代謝產物,因此纖維堆囊菌成為藥用微生物的研究熱點,其中埃博霉素就是由纖維堆囊菌產生的一種具有抗腫瘤活性且具有細胞毒性的大環(huán)內酯類化合物,與紫杉醇具有相似的抗腫瘤機制。但纖維堆囊菌本身代時長、遺傳背景不清晰、操作手段不成熟,不利于進一步的基因改造。黃色粘球菌與纖維堆囊菌具有相似的遺傳背景且基因操作手段比較成熟,因此,將次級代謝基因簇進行異源表達成為解決這些問題更佳的方法。本實驗室前期將埃博霉素基因簇及其上下游序列隨機插入到在黃色粘球菌Mxanthus DZ2中,得到的異源表達ZE系列菌株,但獲得的最高產量僅為1mg/L,與本源菌相差甚遠無法滿足工業(yè)生產需要。因此,本論文嘗試采用基因工程的方法對異源表達菌株進行改造。截至目前,埃坡霉素啟動子改造的報道較少,對于如何選擇和設計有效的啟動子以改善埃博霉素生產的研究仍然缺乏。首先,根據(jù)實驗室前期對埃博霉素基因簇啟動子進行的預測及解析結果,構建了 1-3個核心區(qū)(EP及SP)啟動子簇,并以GFP為報告基因檢測了啟動子簇活性,分析比較了不同啟動子核心區(qū)串聯(lián)個數(shù)對啟動子活性的影響。結果顯示,隨著啟動子串聯(lián)個數(shù)的增加,無論是EP啟動子簇還是SP啟動子簇,其活性均呈現(xiàn)上升趨勢。之后將上述構建的啟動子簇插入到異源表達菌株ZE9、ZE10及KE17中的埃博霉素基因簇前端,在原始啟動子上進行串聯(lián)重復,以檢測該方法對黃色粘球菌異源表達菌株中埃博霉素產生的影響。其中9-1SP、9-1EP和10-3SP三株菌的埃博霉素產量分別增加了 13%、72%和113%。其中以10-3SP產量最高,高達20 mg/L 左右。此外,底物供應也可能是限制埃博霉素生物合成的關鍵點。通過過表達酯酰輔酶A合成酶基因(ACS)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMs),除菌株狀態(tài)發(fā)生變化的10-3SP-19-ACS外,過表達菌株中埃博霉素產量與對應過表達酶含量發(fā)生了同步上升,因此可以初步判斷ACS和SAMs對埃博霉素的生物合成可能起到積極促進作用,過表達該基因會提高埃博霉素的產量。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;Q936
【部分圖文】：

圖１－２黃色粘球菌Ａ運動與Ｓ運動示意圖［８］逡逑

圖１－３四類粘細菌的己知次級代謝產物［１３］逡逑

圖.腳曰.引匕口目目加.腳目.目圖lfi埃博霉素合成基因

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本文編號：2808867