本研究以野生型煙草NC89和轉(zhuǎn)入堿蓬脫水素基因的煙草(DHN-1、DHN-2、DHN-3、DHN-4)為實驗材料,通過Western blot技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù),對獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了分子水平的檢測,同時對溫度和鹽等逆境脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的表達(dá)及植株的生理生化水平進(jìn)行了研究和探索,以揭示脫水素基因在植物中的抗逆機制。研究結(jié)果如下:1.以盤錦紅海灘的翅堿蓬為陽性對照,以野生型煙草為陰性對照,應(yīng)用Western blot技術(shù)對PCR陽性的DHN-1、DHN-2、DHN-3、DHN-4四株轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行表達(dá)水平的檢測。結(jié)果顯示,四株轉(zhuǎn)基因煙草均為陽性,表明外源脫水素基因在煙草中成功表達(dá)了脫水素蛋白。2.通過qRT-PCR技術(shù),分別測定低溫和鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉中脫水素基因的表達(dá)量。結(jié)果分析顯示低溫脅迫條件下,四個轉(zhuǎn)基因植株中Ss DHN基因均上調(diào),但是DHN-1葉片中脫水素基因表達(dá)量在處理12 h時最高,DHN-2、DHN-3、DHN-4葉片中脫水素基因表達(dá)量在處理時間為24 h達(dá)到最高點,而DHN-1根中脫水素基因表達(dá)量在處理24 h時最高,DHN-2、DHN-3、DHN-4根中脫水素基因表達(dá)量在處理時間為12 h時最高;鹽脅迫結(jié)果表明,四個轉(zhuǎn)基因植株中SsDHN基因均上調(diào),DHN-1葉片中脫水素基因表達(dá)量在NaCl濃度為100 mM時最高,DHN-2葉片中脫水素基因表達(dá)量在NaCl濃度為200 mM時最高,DHN-3和DHN-4葉片中脫水素基因表達(dá)量在Na Cl濃度為300 mM達(dá)到最高點,而DHN-1、DHN-2、DHN-3和DHN-4根中脫水素基因表達(dá)量均在NaCl濃度為300 m M時最高。3.通過對野生型煙草和轉(zhuǎn)脫水素基因煙草在不同鹽濃度MS培養(yǎng)基上發(fā)芽率及根長的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),相同鹽濃度下,轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率高于野生型煙草,且通過對比根長發(fā)現(xiàn),無鹽的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的野生型煙草根的伸長長于轉(zhuǎn)基因煙草,但在相同鹽濃度下對比,轉(zhuǎn)基因煙草的根長長于野生型,說明SsDHN基因能夠提高煙草的耐鹽能力;且在200 m M Na Cl濃度下,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片均出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象,將苗轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)基因煙草6 d后葉片恢復(fù)正常而野生型煙草則10 d恢復(fù)。4.分別測定不同鹽濃度處理下,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片和根部的K~+和Na~+含量發(fā)現(xiàn),不同Na Cl濃度處理下,轉(zhuǎn)基因煙草中K~+的含量呈增加的趨勢,且轉(zhuǎn)基因煙草DHN3在鹽脅迫下K~+的含量均高于野生型,當(dāng)NaCl濃度為400 mM時,轉(zhuǎn)基因煙草根中的K~+含量趨于0;鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草中Na~+的含量比正常條件下高,但是相同濃度NaCl處理下,轉(zhuǎn)基因煙草中Na~+的含量低于野生型;說明Ss DHN基因能夠維持細(xì)胞內(nèi)K~+和Na~+的平衡,而使植物免受離子毒害作用。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

設(shè)置曝光時間為 20 s，運行，獲取圖片，保存圖片。與分析質(zhì)定量結(jié)果準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)溶液的吸光值如下表：表 2-5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度及吸光值Table 2-5 Standard protein concentration and absorbance values溶液 BSA 含量（μL） 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/μL） 吸光值0 0 0100 0.121 0.395200 0.204 0.628300 0.292 0.875400 0.420 1.232500 0.483 1.409白濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

Table 2-6 Sample absorbance and protein concentration樣品編號 吸光值 蛋白濃度（μg/μL）CK+1.578 0.543CK-1.106 0.375DHN-1 1.469 0.504DHN-2 1.493 0.513DHN-3 1.309 0.447DHN-4 1.521 0.523其中 CK+為堿蓬，CK-為野生型煙草，DHN-1—DHN-4 為轉(zhuǎn)基因煙草。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析根據(jù)計算出的各個蛋白濃度，以 15 μg 蛋白上樣量計算上樣的體積進(jìn)行 SDS電泳。為了驗證克隆所得的預(yù)測其平均蛋白分子量理論值為 27 KDa 的 SsD經(jīng)過 SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，在陽性對照、陰性對照和轉(zhuǎn)基 kDa 處均有清晰的蛋白條帶，說明脫水素蛋白可能在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表步驗證 27 KDa 處的蛋白是否為脫水素蛋白，接下來進(jìn)行 Western blot。

Westernblot雜交圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 敖金霞;高學(xué)軍;仇有文;郭士成;;實時熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2009年06期

2 張燕婉;葉玨;時那;孟憲敏;王來元;;蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)的實驗研究[J];實驗技術(shù)與管理;2008年10期

3 趙煥英;包金風(fēng);;實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2007年04期

4 王甜;陳慶富;;熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用[J];種子;2007年02期

5 丁曉東;馬國文;;實時熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年06期

6 宋志軍;宋長緒;楊增岐;朱道中;武占銀;蔣智勇;林志雄;劉燕玲;張福良;;豬生殖與呼吸綜合征病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2006年02期

7 孫歆,雷韜,袁澍,林宏輝;脫水素研究進(jìn)展[J];武漢植物學(xué)研究;2005年03期

本文編號：2808718