【摘要】：本文針對(duì)優(yōu)質(zhì)淡水珍珠蚌池蝶蚌基于LPS誘導(dǎo)下MyD88依賴途徑的免疫相關(guān)基因分子結(jié)構(gòu)特征、組織表達(dá)規(guī)律以及互作關(guān)系進(jìn)行探究。以池蝶蚌性腺轉(zhuǎn)錄組中部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)RACE-PCR技術(shù)獲得池蝶蚌LBP、TLR4、MyD88和AP-1(以下分別簡(jiǎn)稱HsLBP、HsTLR4、HsMyD88、HsAP-1)四個(gè)基因的cDNA全長(zhǎng),結(jié)果顯示,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的cDNA全長(zhǎng)分別為1885bp、3519bp、1863bp和1641bp,分別含有1506bp、2694bp、1428bp和888bp的最大ORF。HsLBP、HsTLR4和HsAP-1的3’UTR均含有“AATAAA”的加尾信號(hào)。生物信息學(xué)分析顯示,HsLBP和HsTLR4的蛋白質(zhì)N端都有一段信號(hào)肽,屬于分泌蛋白或跨膜蛋白;HsLBP蛋白含有BPI1和BPI2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域;HsTLR4蛋白含有LRRs和TIR兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域和一段螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜域;HsMyD88蛋白含有DD和TIR兩個(gè)結(jié)構(gòu)域;HsAP-1蛋白含有Jun-like transcription factor和BRLZ結(jié)構(gòu)域。Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示:HsLBP與三角帆蚌的HcBPI/LBP1同源性最高,相似性和一致性高達(dá)98%;HsTLR4與蝦夷扇貝的MyTLR3同源性最高,一致性達(dá)45%,相似性達(dá)62%,而HsTLR4-TIR與人的TLR4具有最高的相似性和一致性,分別為44%和25%;Hs MyD88與三角帆蚌的HcMy D88-2同源性最高,相似性和一致性高達(dá)99%;HsAP-1與菲律賓蛤仔的RpAP-1同源性最高,相似性和一致性分別為69%和60%。在池蝶蚌中,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1均能在多種組織(血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、外套膜、腎臟、鰓、閉殼肌、斧足、性腺和腸)中表達(dá),具有表達(dá)普遍性。HsLBP mRNA主要在鰓、血細(xì)胞和肝胰腺中表達(dá),在斧足和閉殼肌中的表達(dá)量較低;HsTLR4和HsMyD88 mRNAs均主要在鰓和肝胰腺中表達(dá),在血細(xì)胞和外套膜中的表達(dá)量較低;HsAP-1 mRNA主要在肝胰腺中表達(dá),在外套膜中的表達(dá)量較低。LPS誘導(dǎo)后,HsLBP mRNA的表達(dá)水平在6h時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)下調(diào),而在12h時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)顯著上調(diào)(p0.05);HsTLR4和HsMyD88 mRNAs表達(dá)模式類似,均在6h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)(p0.05),在鰓中表現(xiàn)的最為明顯;HsAP-1 mRNA表達(dá)水平在6h時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)顯著上調(diào)(p0.05),在血細(xì)胞中表現(xiàn)最為明顯,為極顯著上調(diào)(p0.01)。本文對(duì)HsTLR4和Hs MyD88之間的關(guān)系作了進(jìn)一步的探究。首先,根據(jù)酵母雙雜交的原理探討了HsTLR4和HsMyD88之間存在直接的相互作用;其次在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中使用雙分子熒光互作實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了HsTLR4和HsMyD88之間存在直接的相互作用;并且進(jìn)一步采用雙分子熒光互作實(shí)驗(yàn)來(lái)探究它們的結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,HsTLR4的TIR結(jié)構(gòu)域可以和HsMyD88的Death結(jié)構(gòu)域或TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用,但TIR-Death之間相互作用發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度要比TIR-TIR之間的弱;同時(shí)通過(guò)GST-pulldown和western blot實(shí)驗(yàn)證明,HsTLR4和Hs MyD88之間能夠相互作用,并且TIR-Death之間也能發(fā)生相互作用,TIR-Death結(jié)構(gòu)域間發(fā)生的相互作用可能是因?yàn)槲⑿〉撵o電作用而導(dǎo)致。本論文通過(guò)RACE-PCR在池蝶蚌血細(xì)胞和鰓中克隆得到先天免疫相關(guān)基因HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的cDNA全長(zhǎng),進(jìn)行生物信息學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1具有保守性;LPS誘導(dǎo)后,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)。同時(shí)通過(guò)酵母雙雜交、雙分子熒光互作和GST-pulldown等證明HsTLR4和HsMyD88之間能夠直接發(fā)生相互作用,并且主要是通過(guò)TIR-TIR結(jié)構(gòu)域之間相互作用而產(chǎn)生的。本研究首次在池蝶蚌中發(fā)現(xiàn)并鑒定了HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1四個(gè)基因,并且在淡水貝類中首次揭示了HsTLR4能夠與HsMyD88直接發(fā)生相互作用。因此,在池蝶蚌中存在應(yīng)答于LPS的HsMyD88依賴信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

圖 1.1 TLRs 的胞外域 LRRs 的結(jié)構(gòu)(a)和 TLRs 的結(jié)構(gòu)(b)[20]Fig. 1.1 Structure of extracellular domains LRRs of TLRs (a) and structure of TLRs (b)[20]1.3 TLRs 種類及其功能

所有TLRs識(shí)別病原微生物的PAMPs后，通過(guò)招募并激活含有

圖 1.2 TLRs 信號(hào)通路示意圖[55]Fig. 1.2 TLRs signal path schematic[55]1.4 TLR4 在哺乳類中信號(hào)通路

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2804305