【摘要】：克氏梭菌是重要的己酸合成菌,己酸合成效率在眾多己酸合成微生物中名列前茅。但長期以來,克氏梭菌的己酸合成途徑關鍵酶編碼基因并未得到鑒定,同時缺乏克氏梭菌的遺傳操作系統(tǒng),難以對克氏梭菌展開代謝工程改造研究。本課題將解析克氏梭菌己酸合成途徑的關鍵酶編碼基因,對于克氏梭菌產(chǎn)己酸關鍵基因中硫解酶編碼基因功能進行解析。通過構建克氏梭菌遺傳操作工具,實現(xiàn)對克氏梭菌的己酸合成途徑代謝工程的改造。具體內(nèi)容包括:(1)克氏梭菌發(fā)酵動力學顯示,當以乙醇和乙酸為底物,克氏梭菌的主要代謝產(chǎn)物為己酸,僅合成少量的丁酸和微量的辛酸;當以乙醇和丁酸根作為碳源時,克氏梭菌產(chǎn)生己酸和微量的辛酸,丁酸呈現(xiàn)出凈消耗。克氏梭菌脂肪酸合成酶系同時具有催化丁酸合成和己酸合成的能力,而酶的體內(nèi)催化功能受初始碳源種類的調(diào)控�？耸纤缶a(chǎn)己酸關鍵基因的轉(zhuǎn)錄分析表明,在己酸合成過程中,各個酶編碼基因呈現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)錄水平和時序性。硫解酶編碼基因(thlA1)和3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶編碼基因(hbd1)轉(zhuǎn)錄水平最高。(2)克氏梭菌具有三個硫解酶編碼基因(thlA1,CKL_3696;thlA2,CKL_3697;thlA3,CKL_3698)。通過轉(zhuǎn)錄組測序結合反轉(zhuǎn)錄-熒光定量RCR對三個硫解酶編碼基因的表達水平和時序表達特征進行了分析。在菌體生長穩(wěn)定期之前,thlA1基因維持恒定表達,thlA2基因表達時序上調(diào),thlA3基因表達時序下調(diào)。當菌體生長進入衰亡期,三個硫解酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平迅速下調(diào)�？梢�,三個硫解酶編碼基因的表達嚴格依賴于菌體生長。硫解酶對(碳四)乙酰乙酰輔酶A的酶動力學測定結果表明,克氏梭菌三個硫解酶對于四碳底物均顯示出相似的底物親和力(K_m),ThlA1對四碳底物的催化效率(k_(cat)/K_m)低于ThlA2和ThlA3。(3)本研究針對克氏梭菌典型菌株DSM555,通過抗性篩選、電轉(zhuǎn)條件優(yōu)化、復制子選擇、啟動子選擇等成功構建了克氏梭菌遺傳操作工具(基因過表達系統(tǒng)),實現(xiàn)了將外源基因在克氏梭菌體內(nèi)的表達。在克氏梭菌體內(nèi)過表達了丙酮丁醇梭菌來源的醇醛脫氫酶編碼基因(adhE2),adhE2過表達菌株產(chǎn)丁醇25 mg·L~(-1),己醇155 mg·L~(-1)。過表達菌株的丁醇和己醇濃度分別比野生型菌株高2.5倍和8.2倍�；谝陨辖Y果本研究得出,克氏梭菌具有三個有催化活性的硫解酶,在克氏梭菌體內(nèi)均呈活躍表達。本論文成功構建出了克氏梭菌基因過表達系統(tǒng),將促進對克氏梭菌的己酸合成機理研究及其代謝工程改造。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78
【圖文】：

第一章 緒論菌展開代謝工程改造。因此本課題將對克氏梭菌己酸合成途徑的關鍵酶編碼基因進行解析，通過發(fā)酵動力學、體內(nèi)表達水平和體外酶學性質(zhì)三個方面對克氏梭菌產(chǎn)己酸關鍵基因及合成六碳骨架的關鍵酶硫解酶功能進行解析。該研究結果可以為 C6 平臺化合物(如己醇、3-羥基己酸)的綠色生物合成提供高效的基因元件。本文首次探索構建克氏梭菌遺傳操作工具，為實現(xiàn)對克氏梭菌的己酸合成途徑代謝工程改造奠定理論和技術基礎。

江南大學碩士學位論文和測序驗證獲得陽性克隆。將連接有 lacZ 基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入克氏梭菌 DSM555 菌株中，以含有 10 μg·mL-1甲砜霉素的乙醇醋酸鈉瓊脂平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。引物 p6-F/lacZ-BamH I-R 進行菌落 PCR 驗證陽性轉(zhuǎn)化子，菌株命名為 DSM555(PthlA1(part)-lacZ)、DSM555(PthlA1(all)-lacZ)和 DSM555(lacZ)，見圖 2-1。

丁酸、己酸和辛酸摩爾比為 3:41:1，質(zhì)量比為 2:33:1(圖3-1)。在此培養(yǎng)條件下，克氏梭菌的主要代謝產(chǎn)物為己酸，僅合成少量的丁酸和微量的辛酸�；诳耸纤缶核岚l(fā)酵動力學特征，我們推測克氏梭菌的短中鏈脂肪酸合成酶系傾向于催化四碳和六碳產(chǎn)物的形成。發(fā)酵動力學分析還表明，丁酸呈現(xiàn)出先合成，再被利用的特征。丁酸之所以能被回用，推測存在兩種可能性：(1)輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶(Cat)具有較為廣泛的底物特異性[10]，Cat 可以將輔酶 A 轉(zhuǎn)移到乙酸上生成乙酰輔酶 A，也可以將輔酶 A 轉(zhuǎn)移到丁酸上，生成丁酰輔酶 A；(2)Cat 催化的丁酸釋放反應為：丁酰輔酶 A+乙酸 丁酸+乙酰輔酶 A，當乙酸被逐漸消耗后，該反應可能傾向于逆向進行，丁酸被回用。無論哪種途徑，丁酸均可以被轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶 A，與一分子乙酰輔酶 A 在硫解酶催化下形成 3-酮基-己酰輔酶 A。圖 3-1 克氏梭菌 DSM555 利用乙醇和乙酸作為碳源的生長、底物利用和產(chǎn)物生成趨勢(A：克氏梭菌生長曲線；B：克氏梭菌底物利用曲線；C：克氏梭菌產(chǎn)物曲線)Fig. 3-1 The profiles of growth, substrate utilization and metabolite production in a batch fermentation ofC. kluyveri DSM555 using ethanol and acetate as carbon sources (A: growth curve of C. kluyveri; B:substrate utilization curve of C. kluyveri; C: product curve of C. kluyveri)當以乙醇和丁酸根作為碳源時，克氏梭菌產(chǎn)生己酸和微量的辛酸，丁酸呈現(xiàn)出凈消耗，無乙酸被檢測到(圖 3-2)�？梢�

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