【摘要】：克氏梭菌是重要的己酸合成菌,己酸合成效率在眾多己酸合成微生物中名列前茅。但長(zhǎng)期以來(lái),克氏梭菌的己酸合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因并未得到鑒定,同時(shí)缺乏克氏梭菌的遺傳操作系統(tǒng),難以對(duì)克氏梭菌展開代謝工程改造研究。本課題將解析克氏梭菌己酸合成途徑的關(guān)鍵酶編碼基因,對(duì)于克氏梭菌產(chǎn)己酸關(guān)鍵基因中硫解酶編碼基因功能進(jìn)行解析。通過(guò)構(gòu)建克氏梭菌遺傳操作工具,實(shí)現(xiàn)對(duì)克氏梭菌的己酸合成途徑代謝工程的改造。具體內(nèi)容包括:(1)克氏梭菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)顯示,當(dāng)以乙醇和乙酸為底物,克氏梭菌的主要代謝產(chǎn)物為己酸,僅合成少量的丁酸和微量的辛酸;當(dāng)以乙醇和丁酸根作為碳源時(shí),克氏梭菌產(chǎn)生己酸和微量的辛酸,丁酸呈現(xiàn)出凈消耗。克氏梭菌脂肪酸合成酶系同時(shí)具有催化丁酸合成和己酸合成的能力,而酶的體內(nèi)催化功能受初始碳源種類的調(diào)控�？耸纤缶a(chǎn)己酸關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄分析表明,在己酸合成過(guò)程中,各個(gè)酶編碼基因呈現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)錄水平和時(shí)序性。硫解酶編碼基因(thlA1)和3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶編碼基因(hbd1)轉(zhuǎn)錄水平最高。(2)克氏梭菌具有三個(gè)硫解酶編碼基因(thlA1,CKL_3696;thlA2,CKL_3697;thlA3,CKL_3698)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合反轉(zhuǎn)錄-熒光定量RCR對(duì)三個(gè)硫解酶編碼基因的表達(dá)水平和時(shí)序表達(dá)特征進(jìn)行了分析。在菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期之前,thlA1基因維持恒定表達(dá),thlA2基因表達(dá)時(shí)序上調(diào),thlA3基因表達(dá)時(shí)序下調(diào)。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,三個(gè)硫解酶編碼基因轉(zhuǎn)錄水平迅速下調(diào)。可見,三個(gè)硫解酶編碼基因的表達(dá)嚴(yán)格依賴于菌體生長(zhǎng)。硫解酶對(duì)(碳四)乙酰乙酰輔酶A的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,克氏梭菌三個(gè)硫解酶對(duì)于四碳底物均顯示出相似的底物親和力(K_m),ThlA1對(duì)四碳底物的催化效率(k_(cat)/K_m)低于ThlA2和ThlA3。(3)本研究針對(duì)克氏梭菌典型菌株DSM555,通過(guò)抗性篩選、電轉(zhuǎn)條件優(yōu)化、復(fù)制子選擇、啟動(dòng)子選擇等成功構(gòu)建了克氏梭菌遺傳操作工具(基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng)),實(shí)現(xiàn)了將外源基因在克氏梭菌體內(nèi)的表達(dá)。在克氏梭菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)了丙酮丁醇梭菌來(lái)源的醇醛脫氫酶編碼基因(adhE2),adhE2過(guò)表達(dá)菌株產(chǎn)丁醇25 mg·L~(-1),己醇155 mg·L~(-1)。過(guò)表達(dá)菌株的丁醇和己醇濃度分別比野生型菌株高2.5倍和8.2倍�；谝陨辖Y(jié)果本研究得出,克氏梭菌具有三個(gè)有催化活性的硫解酶,在克氏梭菌體內(nèi)均呈活躍表達(dá)。本論文成功構(gòu)建出了克氏梭菌基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng),將促進(jìn)對(duì)克氏梭菌的己酸合成機(jī)理研究及其代謝工程改造。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

第一章 緒論菌展開代謝工程改造。因此本課題將對(duì)克氏梭菌己酸合成途徑的關(guān)鍵酶編碼基因進(jìn)行解析，通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)表達(dá)水平和體外酶學(xué)性質(zhì)三個(gè)方面對(duì)克氏梭菌產(chǎn)己酸關(guān)鍵基因及合成六碳骨架的關(guān)鍵酶硫解酶功能進(jìn)行解析。該研究結(jié)果可以為 C6 平臺(tái)化合物(如己醇、3-羥基己酸)的綠色生物合成提供高效的基因元件。本文首次探索構(gòu)建克氏梭菌遺傳操作工具，為實(shí)現(xiàn)對(duì)克氏梭菌的己酸合成途徑代謝工程改造奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文和測(cè)序驗(yàn)證獲得陽(yáng)性克隆。將連接有 lacZ 基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入克氏梭菌 DSM555 菌株中，以含有 10 μg·mL-1甲砜霉素的乙醇醋酸鈉瓊脂平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。引物 p6-F/lacZ-BamH I-R 進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌株命名為 DSM555(PthlA1(part)-lacZ)、DSM555(PthlA1(all)-lacZ)和 DSM555(lacZ)，見圖 2-1。

丁酸、己酸和辛酸摩爾比為 3:41:1，質(zhì)量比為 2:33:1(圖3-1)。在此培養(yǎng)條件下，克氏梭菌的主要代謝產(chǎn)物為己酸，僅合成少量的丁酸和微量的辛酸�；诳耸纤缶核岚l(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征，我們推測(cè)克氏梭菌的短中鏈脂肪酸合成酶系傾向于催化四碳和六碳產(chǎn)物的形成。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析還表明，丁酸呈現(xiàn)出先合成，再被利用的特征。丁酸之所以能被回用，推測(cè)存在兩種可能性：(1)輔酶 A 轉(zhuǎn)移酶(Cat)具有較為廣泛的底物特異性[10]，Cat 可以將輔酶 A 轉(zhuǎn)移到乙酸上生成乙酰輔酶 A，也可以將輔酶 A 轉(zhuǎn)移到丁酸上，生成丁酰輔酶 A；(2)Cat 催化的丁酸釋放反應(yīng)為：丁酰輔酶 A+乙酸 丁酸+乙酰輔酶 A，當(dāng)乙酸被逐漸消耗后，該反應(yīng)可能傾向于逆向進(jìn)行，丁酸被回用。無(wú)論哪種途徑，丁酸均可以被轉(zhuǎn)化為丁酰輔酶 A，與一分子乙酰輔酶 A 在硫解酶催化下形成 3-酮基-己酰輔酶 A。圖 3-1 克氏梭菌 DSM555 利用乙醇和乙酸作為碳源的生長(zhǎng)、底物利用和產(chǎn)物生成趨勢(shì)(A：克氏梭菌生長(zhǎng)曲線；B：克氏梭菌底物利用曲線；C：克氏梭菌產(chǎn)物曲線)Fig. 3-1 The profiles of growth, substrate utilization and metabolite production in a batch fermentation ofC. kluyveri DSM555 using ethanol and acetate as carbon sources (A: growth curve of C. kluyveri; B:substrate utilization curve of C. kluyveri; C: product curve of C. kluyveri)當(dāng)以乙醇和丁酸根作為碳源時(shí)，克氏梭菌產(chǎn)生己酸和微量的辛酸，丁酸呈現(xiàn)出凈消耗，無(wú)乙酸被檢測(cè)到(圖 3-2)�？梢�

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本文編號(hào)：2804144