【摘要】：第一部分通過WGCNA篩選與人膀胱癌病理有關(guān)的分子標(biāo)志物目的:通過權(quán)重共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)研究與膀胱癌臨床病理分級有關(guān)的差異基因及有關(guān)信號通路。方法:從Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載人膀骯癌RNA二代測序原始數(shù)據(jù)。在R軟件中調(diào)用affy包,limma包和WGCNA包對芯片測序數(shù)據(jù)進行處理。構(gòu)建表達矩陣,對樣本數(shù)據(jù)進行分層類聚并篩選低級別(Ta-Tl)和高級別膀胱癌(T2-T4)之間的差異表達基因(Differentially expressed gene,DEG)。采用WGCNA函數(shù)包完成離群樣本和基因的剔除,實現(xiàn)無尺度共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和基因模塊的鑒定,在模塊-特征關(guān)系圖中尋找存在最高相關(guān)性的基因模塊和相應(yīng)的臨床特征。基于基因顯著性和模塊身份,WGCNA函數(shù)包中networkScreening函數(shù)用于篩選目標(biāo)模塊的樞紐基因。樞紐基因(hub genes,HG)和相應(yīng)臨床特征的相關(guān)性通過單因素方差分析和獨立樣本的T檢驗來檢測,并由驗證陣列的數(shù)據(jù)證實目標(biāo)模塊的保守性,以及樞紐基因與臨床特征的相關(guān)性。在STRING數(shù)據(jù)庫中,使用Cytoscape工具,構(gòu)建樞紐基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。在DAVID數(shù)據(jù)庫中,使用注釋工具對樞紐基因行GO(Gene Ontology)功能注釋并行KEGG分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。結(jié)果:生物信息學(xué)方法處理膀胱癌芯片數(shù)據(jù),從93個樣本數(shù)據(jù)里,鑒定出874個上調(diào)基因,420個下調(diào)基因。發(fā)現(xiàn)103個網(wǎng)絡(luò)樞紐基因,其中4個是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)樞紐節(jié)點,COL3A1基因與腫瘤進展具有較高的相關(guān)性,功能和通路富集分析證實COL3A1基因高表達與MAPK信號通路和粘著斑相關(guān)通路(focal adhesion related pathways)具有較大相關(guān)性(FDR0.05)。結(jié)論:生物信息學(xué)權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析證實COL3A1基因與膀胱腫瘤發(fā)生、發(fā)展可能具有密切關(guān)系。第二部分?jǐn)?shù)據(jù)挖掘結(jié)合臨床樣本驗證COL3A1表達與膀胱癌臨床預(yù)后及病理的關(guān)系目的:從組織學(xué)和臨床信息資料基礎(chǔ)上驗證COL3A1 mRNA及蛋白表達水平是否與膀胱癌預(yù)后及病理特征相關(guān)。方法:執(zhí)行線性回歸分析來驗證測試數(shù)據(jù)集中的樞紐基因。基于Ocomine數(shù)據(jù)庫進行分析COL3A1在正常膀胱癌和膀胱癌中表達的差異。從GEPIA數(shù)據(jù)庫中獲得數(shù)據(jù)來執(zhí)行Kaplan-Meier生存曲線分析COL3A1與膀胱癌進展的關(guān)系�；谛酒瑪�(shù)據(jù)集進行COL3A1與膀胱癌生存分析和其與各臨床預(yù)后指標(biāo)的ROC曲線分析。分別收集和保存本院臨床膀胱癌根治術(shù)后的膀胱癌和癌旁組織樣本。將收集的膀胱癌和癌旁組織樣本制成組織芯片,再采用免疫組織化學(xué)方法檢測各樣本膀胱癌和癌旁組織中COL3A1蛋白表達水平。使用qRT-PCR方法檢測收集的膀胱癌和癌旁組織中COL3A1基因mRNA的表達量。結(jié)果:線性回歸分析結(jié)果顯示:COL3A1與膀胱癌臨床分期具有強相關(guān)性(p0.001)�；贠comine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)COL3A1基因的表達不僅僅在正常膀胱癌中高表達,而且與膀胱癌進展有著強相關(guān)性。根據(jù)GEPIA數(shù)據(jù)庫的Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn):在膀胱癌組織COL3A1高表達的病人里,其總生存時間和無病生存期是顯著縮短的。測序芯片生存分析和ROC曲線分析也提示COL3A1表達與相關(guān)臨床預(yù)后指標(biāo)有關(guān)。qRT-PCR結(jié)果顯示膀胱癌組織中COL3A1 mRNA的表達量要比癌旁組織顯著提高(p0.01),組織芯片免疫組織化學(xué)結(jié)果提示高級別膀胱癌組織中COL3A1蛋白高表達水平比低級別膀胱癌患者升高。結(jié)論:COL3A1高表達與膀胱癌的發(fā)生和進展密切相關(guān)。第三部分敲低和過表達COL3A1對膀胱癌細胞系生物學(xué)行為的影響目的:從細胞分子層面研究COL3A1與膀胱癌細胞生物學(xué)行為的相關(guān)性。方法:通過COL3A1shRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞株EJ和UMUC3,從而構(gòu)建EJ-shNC,UMUC3-shNC 以及 EJ-shCOL3A1,UMUC3-shCOL3A1 細胞株模型。EJ 細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1構(gòu)建質(zhì)粒過表達COL3A1組和空載質(zhì)粒組。采用細胞增殖-毒性檢測實驗(MTT)來檢測不同細胞株的增殖能力。采用平板克隆形成實驗檢測不同細胞株的平板克隆形成能力。應(yīng)用細胞劃痕實驗和transwell小室檢測各組細胞的遷移能力。應(yīng)用流式細胞儀檢測各組細胞的周期、凋亡情況。用westernblot方法檢測細胞的MAPK和EMT相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果:通過shRNA技術(shù)敲低膀胱癌細胞株EJ中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平,MTT、平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)EJ-shCOL3A1細胞株的增殖能力明顯降低,流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)敲減COL3A1能阻滯膀胱癌細胞的增殖周期,增加膀胱癌細胞的凋亡率。細胞劃痕試驗也證實COL3A1與膀胱癌細胞系EJ和UNMUC3的遷移能力有關(guān)。COL3A1蛋白敲減的EJ細胞中MAPK和EMT相關(guān)蛋白的表達水平也受到影響。COL3A1過表達能增加UMUC3的增殖活性。結(jié)論:在細胞分子實驗層面證實了 COL3A1與膀胱癌細胞的增殖遷移能力有關(guān),進一步佐證COL3A1與膀胱癌的進展有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.14

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本文編號：2804337