【摘要】：柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起的柑橘潰瘍病是世界性的檢疫病害,嚴(yán)重危害柑橘果實的品質(zhì),對世界柑橘產(chǎn)業(yè)構(gòu)成巨大威脅。目前柑橘潰瘍病的防控主要依賴化學(xué)防治,長期過度使用農(nóng)藥,不僅病原菌產(chǎn)生耐藥性,而且影響果品安全、惡化生態(tài)環(huán)境。因此開展病原菌相關(guān)功能基因研究,解析病原菌致病機理,將為綠色防控技術(shù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)。隨著2002年首個柑橘潰瘍病菌全基因組序列的公布,有力促進病原菌中功能基因的相關(guān)研究。hfq基因編碼的Hfq蛋白(Host Factor for RNA Phage Qβ)廣泛存下于革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌中,作為分子伴侶與sRNA(Small Non-coding RNA)結(jié)合,參與基因的表達調(diào)控。已有研究表明,hfq有調(diào)節(jié)病原菌毒性、游動性、生長力、胞外酶形成等生物學(xué)功能,柑橘潰瘍病菌hfq基因全長279bp,編碼93個氨基酸。為了探究hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的作用,本研究構(gòu)建2個致病力差異菌株(Xcc29-1和Xcc49)hfq基因的缺失突變體(29-1Δhfq和49Δhfq)與回補菌株(29-1Δhfq-C和49Δhfq-C)并進行生物學(xué)特性實驗。初步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌的生長代謝、生物膜形成、胞外酶及胞外多糖的形成、細(xì)菌的游動性、致病性等方面的影響。同時通過原核鏈轉(zhuǎn)錄組測序分析,進一步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的功能。主要研究結(jié)果如下:1、分別擴增hfq基因上下游側(cè)翼序列,連接到自殺載體pK18mobSacB,將獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入潰瘍病菌的感受態(tài)細(xì)胞,優(yōu)化同源重組篩選體系最終獲得2個菌株的hfq基因缺失突變株。擴增含有啟動子的hfq基因,連接到pBBR1MCS-5表達載體上,電轉(zhuǎn)hfq突變株獲得回補菌株。2、將野生型菌株、突變株、回補菌株三者同時進行生物學(xué)實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn),hfq基因的缺失突變株與野生型和回補菌株相比生長緩慢、游動性顯著降低、胞外蛋白酶和胞外淀粉酶的產(chǎn)生也較低、生物膜的形成明顯減少;同時對H2O2和pH脅迫較敏感;但突變株的胞外多糖、致病力等與野生型菌株和回補菌株無顯著差異。生物學(xué)特性實驗表明,hfq基因?qū)Ω涕贊儾【纳L、胞外酶的產(chǎn)生、細(xì)菌游動性、脅迫應(yīng)答有重要作用,對致病力則無顯著影響。3、為進一步明確hfq基因在柑橘潰瘍病菌中的作用,對野生型菌株(Xcc29-1和Xcc49)以及突變株(29-1Δhfq和49Δhfq)進行原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果顯示29-1Δhfq相對于Xcc29-1有746個差異表達基因,其中662個基因下調(diào)表達,84個基因上調(diào)表達;49Δhfq相對于Xcc49有257個差異表達基因,其中172個基因下調(diào),85個基因上調(diào)。突變體相對于野生型菌株下調(diào)的基因主要富集在趨化行為、群體感應(yīng)、鞭毛組分、雙組份系統(tǒng)以及分泌系統(tǒng),上調(diào)基因主要分布在核糖體合成和分泌系統(tǒng)等途徑。鞭毛組分和趨化性相關(guān)基因下調(diào)表達,結(jié)合hfq突變株在半固體培養(yǎng)基上游動性較弱,說明hfq基因參與調(diào)節(jié)柑橘潰瘍病菌的運動相關(guān)基因的表達;群體感應(yīng)中缺失hfq引起部分基因下調(diào)表達,表明該基因參與調(diào)控柑橘潰瘍病菌群體感應(yīng);雙組份系統(tǒng)在響應(yīng)外界環(huán)境變化中有重要作用,其基因下調(diào)表達,結(jié)合突變體比野生型菌株對H2O2和pH更敏感,推測hfq基因可能在柑橘潰瘍病菌的脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用;核糖體是蛋白合成的場所,缺失hfq會引起大量核糖體相關(guān)基因上調(diào)表達,說明hfq可能參與調(diào)節(jié)柑橘潰瘍病菌部分基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。4、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,野生型菌株Xcc29-1和Xcc49菌株在細(xì)菌II型和IV型分泌系統(tǒng)中存在大量差異表達基因,II型分泌系統(tǒng)分泌的酶類物質(zhì)對植物的細(xì)胞壁有降解作用,IV型分泌系統(tǒng)可傳遞毒性相關(guān)DNA。推測兩者致病力存在差異可能與這些基因的差異表達有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.66

【參考文獻】

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本文編號：2803931