【摘要】：家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,蠶桑業(yè)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè),但是蠶病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)蠶業(yè)的發(fā)展。家蠶核型多角體病毒(BmNPV)感染引發(fā)的家蠶血液型膿病是蠶業(yè)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的家蠶病毒病,在生產(chǎn)中最常見,傳染性強(qiáng),易造成大面積爆發(fā)。因此,控制BmNPV的感染和傳播、提高家蠶對(duì)BmNPV的抗性對(duì)桑蠶業(yè)發(fā)展具有重要意義。家蠶脂肪酶1(Bmlipase-1)是一種消化酶,在中腸組織中特異性表達(dá)。Bmlipase-1在BmNPV感染的起始階段能抑制病毒,在蠶體第一道免疫防線中具有抵抗病毒的作用,但其抗病毒機(jī)制并不清楚。對(duì)Bmlipase-1基因的克隆和體外表達(dá)有助于進(jìn)一步探究其抗病毒機(jī)制。本研究對(duì)Bmlipase-1基因進(jìn)行克隆、密碼子優(yōu)化,并利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)家蠶脂肪酶Bmlipase-1,對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析和討論。主要研究方法和結(jié)果如下:1.家蠶脂肪酶基因Bmlipase-1的克隆和生物信息學(xué)分析以5齡家蠶中腸組織為實(shí)驗(yàn)材料,利用TRIZOL法提取其總RNA,以隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得其第一鏈cDNA。設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增獲得Bmlipase-1片段,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中,成功克隆了Bmlipase-1完整CDS序列。生物信息學(xué)分析顯示,其CDS序列全長(zhǎng)885 bp,編碼294個(gè)氨基酸,理論蛋白分子量31.74kDa,理論等電點(diǎn)9.33,不穩(wěn)定指數(shù)23.13,脂肪族指數(shù)76.90,親水性指數(shù)(GRAVY)-0.373,是穩(wěn)定的親水性蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主。2.構(gòu)建畢赤酵母重組菌株GS115/pPICZαA-Bmlipase-1將克隆的Bmlipase-1基因與穿梭質(zhì)粒載體pPICZαA連接,電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中,使得Bmlipase-1基因整合到畢赤酵母基因組中。通過MM和MD平板篩選甲醇利用表型(Mut~+)轉(zhuǎn)化子,菌液PCR及測(cè)序驗(yàn)證成功獲得陽性重組畢赤酵母菌株。利用三丁酸甘油酯乳化平板檢測(cè)轉(zhuǎn)化子脂肪酶活性,結(jié)果顯示,重組菌株菌落比對(duì)照菌株略大,但透明圈大小差異不明顯,推測(cè)透明圈的產(chǎn)生是由于酵母自身脂肪酶的分泌,Bmlipase-1沒有表達(dá)或表達(dá)量很低。3.Bmlipase-1基因密碼子優(yōu)化將克隆的Bmlipase-1基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化和全基因合成,以opt-Bmlipase-1命名。優(yōu)化后的基因以高頻密碼子替換了低頻密碼子,其CAI值由0.68增加至0.97,達(dá)到了高基因表達(dá)水平;GC含量百分比由52.68%調(diào)整為39.35%;延長(zhǎng)了mRNA的半衰期;除去了影響核糖體結(jié)合和mRNA穩(wěn)定性的頸環(huán)結(jié)構(gòu)。4.優(yōu)化后Bmlipase-1基因的表達(dá)及表達(dá)分析將優(yōu)化后的家蠶脂肪酶基因分別與穿梭質(zhì)粒載體pPICZαA和pPIC9K連接,構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-opt-Bmlipase-1和pPIC9K-opt-Bmlipase-1。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中,通過多拷貝篩選、甲醇利用表型篩選、PCR驗(yàn)證及測(cè)序等方法獲得陽性轉(zhuǎn)化子。對(duì)重組畢赤酵母菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),發(fā)酵至144 h。發(fā)酵液上清用TCA法濃縮20倍后進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)果顯示陽性重組子發(fā)酵上清中雜蛋白明顯多于空載對(duì)照菌株,其中一次的發(fā)酵上清在發(fā)酵至144 h時(shí)有疑似目的蛋白條帶,但其他電泳結(jié)果中沒有出現(xiàn)疑似目的蛋白條帶。對(duì)照菌株發(fā)酵上清中蛋白較少,電泳條帶較淺。進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)和Ni-NTA親和層析沒有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。影響外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的因素有很多,對(duì)此結(jié)果我們從目的基因自身特性和發(fā)酵條件等方面進(jìn)行了分析和討論。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;S881.2
【圖文】：

圖 1.1 脂肪酶的催化機(jī)理Fig.1.1 Mechanism of lipase catalysis肪酶都具有 α/β 水解酶折疊的結(jié)構(gòu)特征，即 α 螺旋和 β 折疊[5疊為八鏈的平行 α/β 結(jié)構(gòu)，包含一條反平行于其他鏈的 β2。α 螺旋（αＡ和 αＦ）位于折疊結(jié)構(gòu)的一面，其他 α 螺旋位于另一夠?yàn)槊傅幕钚晕稽c(diǎn)提供一個(gè)穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)。酶的應(yīng)用憑借其多樣的催化功能在很多領(lǐng)域或行業(yè)應(yīng)用廣泛，如食品洗滌劑行業(yè)，醫(yī)藥行業(yè)，造紙工業(yè)，廢水處理和生物柴油制備業(yè)：脂肪酶可用于肉類、果蔬、熏制食品、烘焙、啤酒和奶頭等有增白作用且食品安全性高。還可用于食品添加劑的生酪風(fēng)味的提高等。脂肪酶還廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和茶葉生產(chǎn)行業(yè)：脂肪酶能催化產(chǎn)生表面活性劑和香水的重要成分。脂酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯和軟脂酸異辛脂等可用于防曬霜、[7]

3.1 Bmlipase-1 的 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物0 DNA marker; 1: Bmlipase-1 的 RT-PCR 擴(kuò)增.3.1 RT-PCR amplification of Bmlipase-1 DNA marker; 1: RT-PCR amplification of Bmllipase-1 基因片段與 pMD19-T 載受態(tài)細(xì)胞中，涂布抗性平板，隨R 檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，與目的基因大小一致，初步篩選

圖 3.1 Bmlipase-1 的 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA marker; 1: Bmlipase-1 的 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3.1 RT-PCR amplification of Bmlipase-1M: DL2000 DNA marker; 1: RT-PCR amplification of Bmlipase-1初步篩選純化的 Bmlipase-1 基因片段與 pMD19-T 載體連接，li DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布抗性平板，隨機(jī)挑選若行菌液 PCR 檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖 3.2 右的條帶，與目的基因大小一致，初步篩選到了陽性

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2803790