【摘要】：隨著世界人口的不斷增長,糧食短缺已成為一個(gè)嚴(yán)峻的世界性問題。水稻是最重要的糧食作物之一,養(yǎng)活了全球一半以上的人口。提高水稻產(chǎn)量,對于滿足日益增長的糧食需求、保障糧食安全具有重要意義。fruit weight2.2(FW2.2)是番茄中控制果實(shí)大小的一個(gè)主效QTL,解釋了番茄果實(shí)大小變異的30%。研究表明,FW2.2-like(FWL)基因在植物中廣泛存在,通過負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂控制器官和果實(shí)(種子)的大小,以及參與鎘等金屬離子的響應(yīng)。本研究利用新型CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建了水稻FWL2基因2個(gè)基因敲除突變體系。表型分析表明,突變體株高等性狀與野生型無顯著差異,但每穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量顯著高于對照。進(jìn)一步采用RNA-seq對該基因調(diào)控水稻穗粒數(shù)的分子機(jī)理進(jìn)行了解析。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了OsFWL2基因不同靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因組編輯載體Osfw12a和OsfW12b,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11,分別獲得了 8株和14株轉(zhuǎn)基因陽性植株。突變體基因型分析表明,多數(shù)突變類型為少數(shù)堿基對的插入或刪除。Osfwl2a轉(zhuǎn)基因苗中,1株為純合突變,占比12.5%,6株為雙等位突變,占比75%,1株無突變,占比12.5%;Osfwl2b轉(zhuǎn)基因苗中,3株為純合突變,占比21.4%,9株為雙等位突變,占比64.3%,3株無突變,占比21.4%。兩個(gè)載體均無雜合突變植株。(2)分別選擇Osfwl2a和Osfwl2b載體各一個(gè)純合突變體系作進(jìn)一步分析。其中,Osfwl2a選擇了一個(gè)1 bp插入的突變體,命名為osfwl2a;Osfwl2b選擇了一個(gè)2 bp刪除的突變體,命名為osfwl2b。兩個(gè)突變體攜帶的突變在后代中均能穩(wěn)定遺傳。進(jìn)一步利用一對HPT引物和一對sgRNA引物對T1代突變體中的T-DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,成功分離到了無T-DNA插入的純合突變體。(3)無T-DNA插入的純合突變體株高、旗葉面積、每株穗數(shù)、穗長、每穗一次枝梗數(shù)等與野生型無顯著差異,但突變體穗粒數(shù)與對照相比增加了 14%～18.6%,單株產(chǎn)量增加了 17.2%～17.3%。進(jìn)一步對每穗二次枝梗數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),突變體二次枝梗數(shù)增加了10.9%,表明其穗粒數(shù)的增加可能是由于二次枝梗數(shù)的增加所引起。(4)利用熒光定量PCR進(jìn)行的表達(dá)模式分析表明,該基因主要在發(fā)育中的葉片中表達(dá),但在發(fā)育中的根、莖、穗和種子中也有一定量的表達(dá),并且其在莖稈、穗子和種子中的表達(dá)隨著植株的發(fā)育成熟而逐漸增強(qiáng)。此外,該基因在葉片和根中的表達(dá)均不受鎘處理影響,表明其可能不參與鎘脅迫的響應(yīng)。(5)對野生型和突變體枝梗和穎花分化期的幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,共鑒定出3406個(gè)差異表達(dá)基因,其中,1383個(gè)為上調(diào)基因,2023個(gè)為下調(diào)基因。KEGG富集分析表明,該基因可能參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用等生理過程。綜上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了水稻FWL2基因的基因組編輯突變體并在T1代即分離獲得了無T-DNA插入的純合突變體,表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)是植物尤其是重要作物基因功能研究的有效手段。osfwl2突變體二次枝梗數(shù)、穗粒數(shù)和單株產(chǎn)量顯著增加。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組測序分析表明,該基因可能通過調(diào)控植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等負(fù)調(diào)控上述重要產(chǎn)量性狀。這些結(jié)果為該基因的進(jìn)一步功能研究及在水稻分子育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511;Q943.2
【圖文】：

３．２邐ＯｓＦＦＺＪ基因敲除純合突變體的表型分析逡逑對無Ｔ－ＤＮＡ插入的純合突變體進(jìn)行表型分析表明，突變體株高、旗葉面積等性狀與逡逑野生型無顯著差異（圖３－２）。對突變體穗部性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，突變體每株穗數(shù)、穗長、逡逑每穗一次枝梗數(shù)與野生型也無顯著差異（圖３－３Ｂ－Ｄ），但突變體穗粒數(shù)與對照相比顯著增逡逑力口（圖３－３Ｆ）。其中，（ｗ＞／２ａ平均增加了邋１４％，叫／＾／２６增加了邋１８＿６％。進(jìn)一步對每穗二逡逑次枝梗數(shù)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，突變體二次枝梗數(shù)增加了邋１０．９％，表明其穗粒數(shù)的增加可能是由逡逑于每穗二次枝梗數(shù)的增加所引起（圖３－３Ｅ）。最終，突變體的單株產(chǎn)量平均增加了逡逑１７．２°／。￣１７．３％邋（圖３－３Ｇ）。然而，突變體種子大小與野生型無顯著差異。這些結(jié)果表明該逡逑基因可能參與水稻穗粒數(shù)和產(chǎn)量的調(diào)控。逡逑３．３邐表達(dá)模式分析逡逑Ｘｕ等＿利用半定量ＰＣＲ分析了邐基因在７個(gè)組織器官中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該逡逑基因主要在抽穗期的旗葉和根中表達(dá)。本研宄進(jìn)一步采用熒光定量ＰＣＲ分析了該基因在中逡逑花１１邋１４個(gè)不同組織器官和發(fā)育階段的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因主要在發(fā)育中的葉片中表達(dá)，逡逑但在發(fā)育中的根、莖、穗和種子中也有一定量的表達(dá)

ｉｓ逡逑迫的抗性。本研究不同濃度鎘處理下的分析表明，該基因在葉片和根中的表達(dá)均沒有顯著逡逑差異（圖３＿４Ｂ），說明該基因可能不參與鎘脅迫的響應(yīng)。逡逑ＩＭｉ邋ＬＵ邋Ｌ逡逑中花邋１１邐ｏｓｊｗｌｌａ邐ｏｓＪｗｌ２ｂ邐？逡逑圖３－２邐突變體植株表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌｌ邋ｍｕｔａｎｔｓ逡逑Ａ：植株照片；Ｂ：突變體株高，ｎ＝１０；邋Ｃ：突變體旗葉面積，數(shù)值為１０棵植株的平均值逡逑＿＿逡逑Ｉｍｈｉｉ邋１１ｉ１逡逑中花邋１１邋ｏｓｆｗｌ２ａ邐ｏｓｊ＼＼�。玻膺姡捱姡捱姡捱娏钫棋澹掊义蠄D３－３邐突變體穗部表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌ２邋ｍｕｔａｎｔ邋ｐａｎｉｃｌｅｓ逡逑Ａ：突變體稻穗，比例尺＝５邋ｃｍ；邋Ｂ：突變體每株穗數(shù)，ｎ＝１０；邋Ｃ－Ｆ：突變體穗長、每穗一次枝梗數(shù)、每穗二次枝梗數(shù)和逡逑每穗粒數(shù)，數(shù)值為６棵植株的平均值；Ｇ：單株產(chǎn)量，ｎ＝１０逡逑

ｉｓ逡逑迫的抗性。本研究不同濃度鎘處理下的分析表明，該基因在葉片和根中的表達(dá)均沒有顯著逡逑差異（圖３＿４Ｂ），說明該基因可能不參與鎘脅迫的響應(yīng)。逡逑ＩＭｉ邋ＬＵ邋Ｌ逡逑中花邋１１邐ｏｓｊｗｌｌａ邐ｏｓＪｗｌ２ｂ邐？逡逑圖３－２邐突變體植株表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌｌ邋ｍｕｔａｎｔｓ逡逑Ａ：植株照片；Ｂ：突變體株高，ｎ＝１０；邋Ｃ：突變體旗葉面積，數(shù)值為１０棵植株的平均值逡逑＿＿逡逑Ｉｍｈｉｉ邋１１ｉ１逡逑中花邋１１邋ｏｓｆｗｌ２ａ邐ｏｓｊ＼＼�。玻膺姡捱姡捱姡捱娏钫棋澹掊义蠄D３－３邐突變體穗部表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌ２邋ｍｕｔａｎｔ邋ｐａｎｉｃｌｅｓ逡逑Ａ：突變體稻穗，比例尺＝５邋ｃｍ；邋Ｂ：突變體每株穗數(shù)，ｎ＝１０；邋Ｃ－Ｆ：突變體穗長、每穗一次枝梗數(shù)、每穗二次枝梗數(shù)和逡逑每穗粒數(shù)，數(shù)值為６棵植株的平均值；Ｇ：單株產(chǎn)量，ｎ＝１０逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2803676