【摘要】：動物絲纖維是一種蛋白質類的生物多聚材料,由于它具有出色的生物學活性,已經被廣泛應用于生物醫(yī)學領域。在動物界眾多的絲纖維中,蠶絲和蜘蛛絲是迄今為止最引人注目和研究得最透徹的兩種絲纖維。其中,絲蛋白基因結構,絲蛋白的合成、組裝、分泌、運輸,絲腺的生長發(fā)育以及絲蛋白生物材料的應用,是絲纖維基礎研究的熱題,卻也包含著眾多的未知。本研究選取與家蠶絲蛋白合成相關的裸蛹(Naked Pupa,Nd)突變體作為研究對象,旨在闡明其突變機理,以豐富對絲蛋白合成分泌的認識。Nd突變由單基因控制,呈顯性遺傳,遺傳連鎖將其定位于第25號染色體0.0 cM位點,為家蠶第25號染色體經典的遺傳標記。早期的研究報道Nd突變體的突變表型為后部絲腺退化,繭層僅含絲膠,極薄,多數(shù)不能成繭。本研究通過表型觀察、基因鑒定、通路解析和功能驗證全面地解析了Nd突變的突變機理。主要研究結果如下:1.Nd突變體的絲素蛋白分泌能力缺陷影響泌絲行為泌絲行為調查發(fā)現(xiàn),Nd突變體從蟻蠶孵化起便沒有絲纖維分泌,直至上蔟才能分泌出少量絲膠,形成的絲膠繭薄且易破,不能抽出絲來。解剖觀察五齡第3天的Nd突變體絲腺與大造對比發(fā)現(xiàn),Nd突變體后部絲腺嚴重退化,中部絲腺發(fā)育正常。暗示絲素蛋白分泌能力受阻而絲膠蛋白分泌能力完好。繭絲溶解分析發(fā)現(xiàn),Nd突變體繭絲能夠完全溶解于尿素溶液(常用于絲膠提取),而大造繭絲中有大量不溶絲狀物,暗示Nd突變體繭絲中主要成分為絲膠。以上結果表明Nd突變體絲素蛋白分泌能力從始至終存在缺陷,其后部絲腺發(fā)育受到影響。通過將上蔟期的Nd突變體幼蟲置于不同的上蔟環(huán)境中(普通的塑料網格蔟和優(yōu)異的紙板方格蔟),發(fā)現(xiàn)上蔟環(huán)境對Nd突變體突變表型的穩(wěn)定十分重要,在大小合適的紙板方格蔟中,所有的Nd突變體均能結出絲膠繭,沒有裸蛹表型出現(xiàn)。即優(yōu)異的上蔟環(huán)境為Nd突變體的“絲膠繭”表型穩(wěn)定的必要條件。2.Nd突變體FibH R08-10區(qū)域突變導致形成C端缺失的FibH基于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的連鎖定位分析,將突變基因鎖定在第25號染色體nscaf2823上537 kb的區(qū)域內,該區(qū)域含有13個候選基因。表達模式分析發(fā)現(xiàn)僅編號為BGIBMGA005111的基因呈現(xiàn)出差異表達模式,即該基因在Nd突變體后部絲腺中的表達量顯著低于在大造后部絲腺中的表達量,并注釋為絲素重鏈基因(fibroin heavy chain,FibH)。由此推測FibH為引起Nd突變的候選基因。測序分析發(fā)現(xiàn)Nd突變體FibH編碼區(qū)的NTD與CTD序列沒有變化,而NTD與CTD之間長達15 kb的編碼區(qū)由于富含GC且高度重復難以擴增測序,因此我們在蛋白質水平檢測了突變的發(fā)生。FibH由家蠶后部絲腺特異性合成,通過對后部絲腺蛋白質提取物進行LC-MS檢測,發(fā)現(xiàn)在Nd突變體中僅能檢測到FibH NTD肽段,檢測不到CTD肽段,在大造中則均能檢測到。表明Nd突變體CTD部分發(fā)生缺失或移碼突變。為了進一步驗證檢測結果,我們針對FibH設計并制備了對應不同區(qū)段(N端:NTD,非結晶區(qū)01:A01,非結晶區(qū)02-10:A02-10,C端:CTD)的抗體。免疫熒光結果顯示在Nd突變體中,FibH的熒光信號大部分在后部絲腺細胞中,僅有微弱部分在絲腺腔中(絲素蛋白殘留),表明FibH分泌受阻。與大造對比發(fā)現(xiàn),在Nd突變體后部絲腺細胞中FibH NTD、FibH A01均能檢測到較強的信號,FibH A02-10信號強度驟減,FibH CTD完全無信號。根據(jù)以上結果,推測Nd突變體的FibH在A02-10區(qū)域發(fā)生突變,導致抗體結合靶位點減少,引起熒光強度驟減。Western blot分析發(fā)現(xiàn)Nd突變體FibH編碼一個分子量比正常小的突變FibH(小于390 kDa,大于240 kDa),且能形成聚體。FibH序列分析發(fā)現(xiàn),僅有A07之后的序列突變才能編碼出分子量大于240 kDa的突變FibH。綜上所述,Nd突變體中FibH A07-A10之間的區(qū)域(重復區(qū)R08-R10)發(fā)生突變,導致編碼出C端缺失的截短FibH。3.分泌受阻的突變FibH使絲腺細胞持續(xù)處于壓力應激環(huán)境導致絲腺退化為了闡明C端缺失的FibH與絲腺退化之間的關系,首先使用透射電鏡對Nd突變體和大造后部絲腺亞細胞結構進行對比觀察。結果顯示Nd突變體后部絲腺細胞蛋白質囊泡運輸及分泌系統(tǒng)受阻,細胞質中內質網擴張、高爾基體萎縮、有大量自噬體分布,后部絲腺腔中僅有一些絲素蛋白殘留。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Nd突變體后部絲腺腔中的絲素蛋白殘留不能被向前運輸?shù)街胁拷z腺。結果表明CTD對FibH有效分泌至關重要。FibH為組成蠶絲的主要成分,是一個大分子結構蛋白,不參與具體的信號傳導途徑或分子通路。因此我們通過RNA-seq檢測結構蛋白的突變引起的細胞通路變化。差異表達基因檢測結果發(fā)現(xiàn)1,245個基因在Nd突變體后部絲腺中顯著上調表達,924個基因在Nd突變體后部絲腺中顯著下調表達。差異基因KEGG通路富集分析將Nd突變涉及的分子通路富集到神經退行性疾病(亨廷頓病、阿爾茲海默病和帕金森病)分子通路和細胞在應激條件下啟動的細胞質量控制系統(tǒng)通路。這兩類通路的共同點為:均可因錯誤折疊/組裝的蛋白質在胞內發(fā)生聚集,導致分泌障礙。在Nd突變體中,C端缺失的FibH即為單個重復單元形成的大分子聚體蛋白,且分泌受阻。因此暗示Nd突變體后部絲腺細胞中C端缺失的FibH是激活這些分子通路的原因。器官退行性變化的特點是隨著時間推移愈發(fā)嚴重。我們檢測了Nd突變體整個幼蟲期絲腺的發(fā)育變化,并對RNA-seq鑒定到的細胞自噬、泛素蛋白酶系統(tǒng)和熱激反應通路中的差異基因ATG8/LC3、E3和HSP19.9進行檢測。絲腺發(fā)育變化調查結果表明,Nd突變體后部絲腺細胞數(shù)與大造無差異,但隨著幼蟲生長,后部絲腺退化程度越來越嚴重,細胞核分枝狀發(fā)育越來越不足,以至于五齡末期后部絲腺細胞核內總DNA含量僅為大造的3分之1。值得注意的是這些變化均是從四齡第1天開始以后迅速出現(xiàn)。熒光定量分析發(fā)現(xiàn),四齡第1天是FibH高量表達的時期,意味著在Nd突變體中C端缺失的FibH在細胞中的量增多,ATG8/LC3、E3和HSP19.9的檢測結果顯示它們在Nd突變體中顯著上調表達。推測C端缺失FibH的大量出現(xiàn)激活了細胞自噬、泛素蛋白酶系統(tǒng)和熱激反應等通路,隨著幼蟲的生長,Nd突變體后部絲腺細胞發(fā)育越來越受阻,退化表型也越來越明顯。4.CRISPR/dCas9系統(tǒng)與遺傳雜交分析驗證突變機理利用CRISPR/dCas9轉錄激活系統(tǒng),我們在細胞水平驗證了FibH分泌障礙激活RNA-seq富集到的細胞應激反應通路�；诩倚Q胚胎細胞(BmE)不表達FibH,且不具備FibH分泌條件,首先在FibH啟動子區(qū)域設計3條靶位點sgRNA,再將它們與沒有切割活性而融合激活因子的Cas9蛋白(dCas9-VPR)共轉BmE細胞,熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)sgRNA-T1與dCas9-VPR以9:1的比例共轉,且在轉染后第60h達到內源FibH被激活表達的最大值。檢測60 h時間點ATG8/LC3、E3和HSP19.9的表達水平發(fā)現(xiàn)這3個基因在FibH激活的細胞中顯著上調表達。溶酶體標記探針(Lyso-Tracker)與細胞自噬標記探針(monodansylcadaverine,MDC)染色發(fā)現(xiàn)在FibH激活的細胞中陽性染色細胞數(shù)顯著高于對照。以上結果表明具有分泌障礙的FibH能夠激活了細胞自噬、泛素蛋白酶系統(tǒng)和熱激反應等細胞應激反應通路。Nd突變體為后部絲腺退化的顯性“絲膠繭”突變體(FibH突變),Nd-s突變體為后部絲腺退化的半顯性“絲膠繭”突變體(FibL突變),fibH-k突變體為后部絲腺正常的隱性“絲膠繭”突變體(FibH突變)。正確的絲素小體結構是FibH高效分泌的必要條件,以上3類突變均由絲素小體結構異常導致。Nd突變與Nd-s突變形成具有分泌障礙的大分子高重復FibH,導致絲腺退化;fibH-k突變形成僅含部分NTD的小分子FibH,分泌系統(tǒng)與絲腺發(fā)育正常。熒光定量檢測發(fā)現(xiàn),以上3種突變體FibH表達水平顯著低于大造,但只有在后部絲腺退化的Nd突變體與Nd-s突變體中檢測到ATG8/LC3、E3和HSP19.9的顯著上調表達。暗示絲腺退化的發(fā)生與細胞應激反應通路的激活有關。將上述3種突變體與正常大造雜交,發(fā)現(xiàn)Nd/+雜合體后部絲腺退化,fibH-k/+雜合體后部絲腺恢復到同大造一樣,Nd-s/+雜合體后部絲腺介于二者之間。基因表達檢測發(fā)現(xiàn)ATG8/LC3、E3和HSP19.9在后部絲腺退化的Nd/+雜合體后部絲腺中均上調表達,在表型有所恢復的Nd-s/+雜合體后部絲腺中僅E3和HSP19.9上調表達。研究結果顯示后部絲腺細胞中應激反應越劇烈,絲腺退化越嚴重。5.Nd突變體顯性產生不含絲素蛋白的絲膠繭對純合的Nd突變體、Nd-s突變體和fibH-k突變體及其雜合后代的繭絲進行分析,發(fā)現(xiàn)純合突變體的繭均很薄且易破,能在尿素溶液中完全溶解。而在雜合后代中,僅Nd/+雜合體的繭能完全溶解,表明Nd突變體具有顯性產生絲膠繭的能力。Nd-s/+雜合體產生的繭中含有正常繭一半量的絲素成分。fibH-k/+雜合體產生的繭中絲素的量與正常繭無差異。Western blot分析發(fā)現(xiàn)Nd突變體和Nd-s突變體的繭中不含任何絲素蛋白組分(FibH、Fib L和P25),fibH-k突變體的繭中雖然不含F(xiàn)ibH,卻含有FibL與P25。在雜合后代中,僅Nd/+雜合體的繭中不含任何絲素蛋白組分。以上結果表明僅Nd突變體及其雜交后代能產生不含任何絲素蛋白組分的絲膠繭。利用Nd突變體產生的絲膠繭,比較3種提取方法對絲膠完整度的影響,發(fā)現(xiàn)LiSCN提取法可以獲得結構完整的絲膠蛋白,尿素提取法使最大分子量絲膠發(fā)生降解,H_2O提取法是所有絲膠條帶均發(fā)生降解。凝膠制備實驗發(fā)現(xiàn)僅LiSCN法提取的絲膠蛋白可以通過構象改變而非化學/物理交聯(lián)形成有彈性的凝膠。結果表明利用絲膠繭以及LiSCN提取法可以獲得結構完整的絲膠蛋白。利用Nd突變體顯性產生絲膠繭的能力,能通過將其與不同繭質的生產用種或絲膠啟動子表達外源蛋白的轉基因品種雜交,獲得結構功能多樣絲膠繭,便于對絲膠的研究和拓展絲膠材料在生物醫(yī)藥領域的應用。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78
【圖文】：

西南大學博士學位論文纖維。將絲纖維有規(guī)律地交織、搭建起來稱之為紡絲。在所有泌絲昆蟲目中，僅紡足目、膜翅目和鱗翅目昆蟲具有紡絲能力。這些昆蟲的絲蛋白具備的無規(guī)卷曲螺旋或β折疊結構能使其易于分泌、沉積或噴射。這些結果表明，原始的昆蟲和化衍生出的新昆蟲之間，除了在絲蛋白氨基酸序列上的差異外，紡絲行為的差異是泌絲昆蟲進化的重要體現(xiàn)[2]。

Antheraeayamamai）、蓖麻蠶（Philosamiacynthiaricini）、塔色蠶（Ana）和琥珀蠶（Antheraea assama）等，它們體內的絲腺非常發(fā)達，泌絲昆蟲強。蠶絲是目前已知利用最早、產量最大的蛋白質類高分子材料類研究得最為深入的纖維蛋白之 ，在經濟上具有極高的價值[19]。蜘蛛絲泌絲昆蟲不同的是，蜘蛛雖然也屬節(jié)肢動物門，但它卻是chnoidea）蜘蛛目（Araneae）所有種屬的統(tǒng)稱，與蝎子、蜈蚣是近親地生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的捕食性天敵，在維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中起到作用。相比于蠶絲的廣泛應用，蜘蛛雖然早在 4 億年前就生存在地球絲的研究和利用卻不如蠶絲那樣歷史悠久。目前世界上大約有 4 萬從生活習性上，可以將蜘蛛大致分為結網蜘蛛（Orb-weaverspider）、untingorwanderingspiders）和洞穴蜘蛛（Cavespiders）三類，所有的，其中結網蜘蛛占整個種類的 50%左右。在眾多奇形怪狀的蜘蛛網中00 種蜘蛛能夠織成形狀相對對稱且功能齊全的平面圓形蜘蛛網（orb-

西南大學博士學位論文小完全不同，但他們的功能基本類似（圖 1.3）。其中，大囊狀腺（Majorampullategland）為蜘蛛的主要絲腺，產生能懸吊蜘蛛的牽引絲、蜘蛛網框架絲和放射狀絲；小囊狀腺（Minorampullategland）為蜘蛛的次要絲腺，產生牽引絲的附著絲、增強絲或蜘蛛網起始旋節(jié)；鞭毛狀腺（Flagelliform gland）產生螺旋狀捕獲絲的核心纖維；聚集狀腺（Aggregategland）產生旋轉狀捕獲絲的粘附絲蛋白，是以糖蛋白為主的黏液，有很強的黏結作用；管狀腺（Cylindricalgland）產生蜘蛛卵袋外層絲，用于保護蜘蛛卵；葡萄串狀腺（Aciniform gland）產生包裹獵物的絲及卵袋內層的絲纖維；梨狀腺（Pyriform gland）產生黏附和連接纖維，也可以用于捆綁獵物[22,23]。

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本文編號：2802300