【摘要】：哈維弧菌(Vibrio harveyi)作為海水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病菌,可感染多種魚、蝦、蟹等并造成大量的死亡,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中受到高度重視。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)主要存在于革蘭氏陰性細菌中,具有增強生物膜形成的特性及識別非己的功能,并參與了細菌間的相互作用,表現(xiàn)出復雜多樣的生物學功能。為了研究哈維弧菌的T6SS,本研究選擇T6SS中針尖狀結(jié)構(gòu)的纈氨酸-甘氨酸重復蛋白(VgrG)、T6SS負責運輸效應因子并作為分子伴侶的溶血素協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)、依靠T6SS分泌的核糖體結(jié)合蛋白(RbsB)作為主要研究對象,分析其序列特征及其進化關(guān)系,制備原核表達重組蛋白及其多克隆抗體,建立qPCR技術(shù);利用已建立的qPCR技術(shù)研究不同培養(yǎng)條件對三者表達的影響;最后通過敲除vgrG、rbsB、hcp及其相關(guān)的基因,研究三者同其調(diào)控基因在T6SS,以及T6SS在整個細菌致病機制中發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下:1、rbsB、vgrG、hcp基因分別包含879 bp、1836bp、480bp DNA序列長度,可分別編碼292aa、611aa、159aa。RbsB蛋白為可分泌的周質(zhì)蛋白,在運載結(jié)合中發(fā)揮作用;VgrG蛋白與T4噬菌體gp27/gp5組件同源,幫助細菌錨定宿主細胞分泌效應因子;Hcp蛋白與T4噬菌體gp19/gp5同源,可形成六聚體通道,以供小分子蛋白分泌及自身轉(zhuǎn)運。從rbsB、hcp到vgrG基因,三者的屬間變異率逐漸升高,在哈維弧菌類的相似率分別為97-100%、99-100%和70-99%,在弧菌屬內(nèi)的相似率分別在90%、84%和40%以上,這同它們的生物學功能特點一致。2、研究了哈維弧菌菌株354在不同培養(yǎng)條件(溫度、鹽度、pH、銅離子、鐵離子)下培養(yǎng)4、8、12、24、48h后rbsB、vgrG、hcp mRNA表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):rbsB mRNA,在28℃、1%NaCl、pH7.5、無Fe~(3+)、無Cu~(2+)培養(yǎng)條件下,隨時間呈凹型表達模式,即在生長對數(shù)期為典型洼地。僅提高培養(yǎng)溫度,其中后期表達量明顯提高;改變鹽度,在早期呈現(xiàn)高鹽誘導效應;調(diào)節(jié)pH,則無論偏酸或者偏堿,俱提高其中后期表達;添加Fe~(3+),可見高濃度Fe~(3+)抑制早期的rbsB表達;添加Cu~(2+),則無明顯誘導效應。vgrG mRNA,在高溫培養(yǎng)條件下,其表達受到抑制;低滲(0.5%)明顯誘導基因在整個培養(yǎng)過程中的高表達,高滲影響不顯著,都呈凹表達模式;在偏酸或偏堿條件下,早期對于其表達無影響,中后期誘導表達量的上升;對于添加Fe~(3+)實驗組而言,高濃度鐵離子顯著誘導vgrG高表達;適當濃度的銅離子(1mM、2mM)可刺激vgrG的表達,在培養(yǎng)中后期其表達量明顯升高,而高濃度銅離子則在一定程度上抑制vgrG的表達。hcp在僅提高培養(yǎng)溫度的情況下,其mRNA的表達與呈現(xiàn)凹型表達的對照組無明顯差別,在培養(yǎng)后期其表達量呈現(xiàn)降低的趨勢;改變鹽度,添加3%NaCl在細菌生長對數(shù)期可刺激hcp的表達,繼續(xù)提高鹽度,其表達水平在細菌培養(yǎng)前期受到抑制,后期表達量才有明顯提高;無論偏酸或偏堿,均提高hcp在細菌生長后期的表達水平;添加鐵離子,可一定程度上促進hcp的表達;而銅離子可顯著刺激細菌培養(yǎng)中后期hcp的表達量(P0.05)。3、為進一步探究vgrG與hcp、rbsB基因在T6SS中的功能,以及T6SS在哈維弧菌中的功能,成功構(gòu)建rbsB、luxp、luxO、vgrG、vasC哈維弧菌缺失株,對hcp表達量差異、生物膜形成能力、運動性、以及共培養(yǎng)條件下對外源菌拮抗性進行探究。結(jié)果表明與野生株相比,各敲除株hcp表達量都有不同程度的提高,說明該hcp在T6SS中存在負調(diào)控功能;在細菌運動能力方面,ΔrbsB與Δluxp菌株在軟瓊脂平板上的擴散能力要強于野生株及其余幾株突變菌;在生物膜形成能力上,各缺失株均弱于野生株,說明生物膜的形成需要T6SS的參與;在與大腸桿菌共培養(yǎng)的拮抗實驗中,與對照組相比,哈維弧菌野生株與突變株都表現(xiàn)出了不同程度對大腸桿菌的拮抗能力,然而vasC突變株卻并不體現(xiàn)該特點。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S941.4
【圖文】：

4）供能組分：ClpV。ClpV 通過 ATP 酶的水解作用供能，能使分泌蛋白過程，從而在膜融合、蛋白修復和降解等過程中發(fā)揮重要作用[76]。5）膜聯(lián)蛋白 IcmF：IcmF 是具 ATP 酶活性的結(jié)構(gòu)蛋白，具有三個跨膜螺參與 Hcp 管道的形成與跨膜轉(zhuǎn)運，且細菌 IcmF 缺失株在培養(yǎng)過程中無法檢測到 Hcp 蛋白[77]。 作用機制先基底復合物與 Hcp 管同時形成，基底復合物可能由 gp25，VgrG 和其蛋白質(zhì)構(gòu)成，共同跨越內(nèi)外膜與肽聚糖；第二步是外鞘的聚合，VipA/VipB繞 Hcp 管拼裝，裝配好的組件形成一個“注射器”的結(jié)構(gòu)�；讖秃衔锷�，導致 VgrG / Hcp 管穿透效應細胞膜向鄰近靶細胞膜分泌，其他分泌蛋用 Hcp 管作為管道分泌至靶細胞或胞外環(huán)境；最后，收縮鞘分離且被 Ce 分解，游離的 VipA/B 二聚體再參與新的 T6SS 裝配過程。當不錨定相應，Hcp 和 VgrG 可作為分泌蛋白釋放到胞外。

分泌蛋白參與弧菌毒力調(diào)控并影響毒力強弱；除參與菌間競爭外，T6SS 可幫助細菌適應環(huán)境，那是否同時參與菌間互利共生也是未知的。實驗室前期對哈維弧菌354進行基因組測序后發(fā)現(xiàn)該菌存在兩套T6SS，分別位于兩條染色體上（如圖1-2），兩套 T6SS 究竟如何行使功能仍有待探究。因此本研究對位于第二條染色體上編碼T6SS 的兩個重要結(jié)構(gòu)蛋白 Hcp、VgrG，與分泌蛋白 RbsB 的基因進行克隆，研究哈維弧菌在不同培養(yǎng)條件，如溫度、鹽度、pH 等環(huán)境因子脅迫下 3 種基因表達量的變化，同時構(gòu)建 T6SS 相關(guān)基因缺失株，探究哈維弧菌 T6SS 功能及作用機制，為哈維弧菌的防控與治療提供理論基礎。圖 1-2 哈維弧菌 354 T6SS ?

Tab. 2-4 Homology analysis of amino acids of RbsB from V. harveyi 354 strain and othbacterial species菌種 Species同源性%Homology注冊號Accession N.o哈維弧菌（V. harveyi ATCC 33843） 100 % AIV07307.1歐文弧菌（V. owensii CAIM 1854） 100 % KIF46393.1氏弧菌（V. campbellii ATCC BAA-1116） 98 % AGU97393.1輪蟲弧菌（V. rotiferianus HM-10） 98 % OHY94262.1藻弧菌（V. alginolyticus ATCC 17749） 97 % GAD69766.1血弧菌（V. parahaemolyticus ATCC 17802） 97 % KKI09273.1需鈉弧菌（V. natriegens ATCC 14048） 97 % EPM40141.1貽貝弧菌（V. mytili CAIM 528） 96 % KIN10841.1創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus ATCC 33147） 92 % KGK71697.1遠青弧菌（V. azureus NBRC 104587） 92 % GAD74752.1

【參考文獻】

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本文編號：2802824