發(fā)布時(shí)間：2020-08-24 20:38

【摘要】：哈維弧菌(Vibrio harveyi)作為海水養(yǎng)殖業(yè)重要的致病菌,可感染多種魚、蝦、蟹等并造成大量的死亡,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中受到高度重視。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中,具有增強(qiáng)生物膜形成的特性及識(shí)別非己的功能,并參與了細(xì)菌間的相互作用,表現(xiàn)出復(fù)雜多樣的生物學(xué)功能。為了研究哈維弧菌的T6SS,本研究選擇T6SS中針尖狀結(jié)構(gòu)的纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白(VgrG)、T6SS負(fù)責(zé)運(yùn)輸效應(yīng)因子并作為分子伴侶的溶血素協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)、依靠T6SS分泌的核糖體結(jié)合蛋白(RbsB)作為主要研究對(duì)象,分析其序列特征及其進(jìn)化關(guān)系,制備原核表達(dá)重組蛋白及其多克隆抗體,建立qPCR技術(shù);利用已建立的qPCR技術(shù)研究不同培養(yǎng)條件對(duì)三者表達(dá)的影響;最后通過敲除vgrG、rbsB、hcp及其相關(guān)的基因,研究三者同其調(diào)控基因在T6SS,以及T6SS在整個(gè)細(xì)菌致病機(jī)制中發(fā)揮的作用。主要結(jié)果如下:1、rbsB、vgrG、hcp基因分別包含879 bp、1836bp、480bp DNA序列長度,可分別編碼292aa、611aa、159aa。RbsB蛋白為可分泌的周質(zhì)蛋白,在運(yùn)載結(jié)合中發(fā)揮作用;VgrG蛋白與T4噬菌體gp27/gp5組件同源,幫助細(xì)菌錨定宿主細(xì)胞分泌效應(yīng)因子;Hcp蛋白與T4噬菌體gp19/gp5同源,可形成六聚體通道,以供小分子蛋白分泌及自身轉(zhuǎn)運(yùn)。從rbsB、hcp到vgrG基因,三者的屬間變異率逐漸升高,在哈維弧菌類的相似率分別為97-100%、99-100%和70-99%,在弧菌屬內(nèi)的相似率分別在90%、84%和40%以上,這同它們的生物學(xué)功能特點(diǎn)一致。2、研究了哈維弧菌菌株354在不同培養(yǎng)條件(溫度、鹽度、pH、銅離子、鐵離子)下培養(yǎng)4、8、12、24、48h后rbsB、vgrG、hcp mRNA表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):rbsB mRNA,在28℃、1%NaCl、pH7.5、無Fe~(3+)、無Cu~(2+)培養(yǎng)條件下,隨時(shí)間呈凹型表達(dá)模式,即在生長對(duì)數(shù)期為典型洼地。僅提高培養(yǎng)溫度,其中后期表達(dá)量明顯提高;改變鹽度,在早期呈現(xiàn)高鹽誘導(dǎo)效應(yīng);調(diào)節(jié)pH,則無論偏酸或者偏堿,俱提高其中后期表達(dá);添加Fe~(3+),可見高濃度Fe~(3+)抑制早期的rbsB表達(dá);添加Cu~(2+),則無明顯誘導(dǎo)效應(yīng)。vgrG mRNA,在高溫培養(yǎng)條件下,其表達(dá)受到抑制;低滲(0.5%)明顯誘導(dǎo)基因在整個(gè)培養(yǎng)過程中的高表達(dá),高滲影響不顯著,都呈凹表達(dá)模式;在偏酸或偏堿條件下,早期對(duì)于其表達(dá)無影響,中后期誘導(dǎo)表達(dá)量的上升;對(duì)于添加Fe~(3+)實(shí)驗(yàn)組而言,高濃度鐵離子顯著誘導(dǎo)vgrG高表達(dá);適當(dāng)濃度的銅離子(1mM、2mM)可刺激vgrG的表達(dá),在培養(yǎng)中后期其表達(dá)量明顯升高,而高濃度銅離子則在一定程度上抑制vgrG的表達(dá)。hcp在僅提高培養(yǎng)溫度的情況下,其mRNA的表達(dá)與呈現(xiàn)凹型表達(dá)的對(duì)照組無明顯差別,在培養(yǎng)后期其表達(dá)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì);改變鹽度,添加3%NaCl在細(xì)菌生長對(duì)數(shù)期可刺激hcp的表達(dá),繼續(xù)提高鹽度,其表達(dá)水平在細(xì)菌培養(yǎng)前期受到抑制,后期表達(dá)量才有明顯提高;無論偏酸或偏堿,均提高h(yuǎn)cp在細(xì)菌生長后期的表達(dá)水平;添加鐵離子,可一定程度上促進(jìn)hcp的表達(dá);而銅離子可顯著刺激細(xì)菌培養(yǎng)中后期hcp的表達(dá)量(P0.05)。3、為進(jìn)一步探究vgrG與hcp、rbsB基因在T6SS中的功能,以及T6SS在哈維弧菌中的功能,成功構(gòu)建rbsB、luxp、luxO、vgrG、vasC哈維弧菌缺失株,對(duì)hcp表達(dá)量差異、生物膜形成能力、運(yùn)動(dòng)性、以及共培養(yǎng)條件下對(duì)外源菌拮抗性進(jìn)行探究。結(jié)果表明與野生株相比,各敲除株hcp表達(dá)量都有不同程度的提高,說明該hcp在T6SS中存在負(fù)調(diào)控功能;在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力方面,ΔrbsB與Δluxp菌株在軟瓊脂平板上的擴(kuò)散能力要強(qiáng)于野生株及其余幾株突變菌;在生物膜形成能力上,各缺失株均弱于野生株,說明生物膜的形成需要T6SS的參與;在與大腸桿菌共培養(yǎng)的拮抗實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,哈維弧菌野生株與突變株都表現(xiàn)出了不同程度對(duì)大腸桿菌的拮抗能力,然而vasC突變株卻并不體現(xiàn)該特點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S941.4
【圖文】：

4）供能組分：ClpV。ClpV 通過 ATP 酶的水解作用供能，能使分泌蛋白過程，從而在膜融合、蛋白修復(fù)和降解等過程中發(fā)揮重要作用[76]。5）膜聯(lián)蛋白 IcmF：IcmF 是具 ATP 酶活性的結(jié)構(gòu)蛋白，具有三個(gè)跨膜螺參與 Hcp 管道的形成與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，且細(xì)菌 IcmF 缺失株在培養(yǎng)過程中無法檢測(cè)到 Hcp 蛋白[77]。 作用機(jī)制先基底復(fù)合物與 Hcp 管同時(shí)形成，基底復(fù)合物可能由 gp25，VgrG 和其蛋白質(zhì)構(gòu)成，共同跨越內(nèi)外膜與肽聚糖；第二步是外鞘的聚合，VipA/VipB繞 Hcp 管拼裝，裝配好的組件形成一個(gè)“注射器”的結(jié)構(gòu)�；讖�(fù)合物上，導(dǎo)致 VgrG / Hcp 管穿透效應(yīng)細(xì)胞膜向鄰近靶細(xì)胞膜分泌，其他分泌蛋用 Hcp 管作為管道分泌至靶細(xì)胞或胞外環(huán)境；最后，收縮鞘分離且被 Ce 分解，游離的 VipA/B 二聚體再參與新的 T6SS 裝配過程。當(dāng)不錨定相應(yīng)，Hcp 和 VgrG 可作為分泌蛋白釋放到胞外。

分泌蛋白參與弧菌毒力調(diào)控并影響毒力強(qiáng)弱；除參與菌間競(jìng)爭(zhēng)外，T6SS 可幫助細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境，那是否同時(shí)參與菌間互利共生也是未知的。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)哈維弧菌354進(jìn)行基因組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該菌存在兩套T6SS，分別位于兩條染色體上（如圖1-2），兩套 T6SS 究竟如何行使功能仍有待探究。因此本研究對(duì)位于第二條染色體上編碼T6SS 的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)蛋白 Hcp、VgrG，與分泌蛋白 RbsB 的基因進(jìn)行克隆，研究哈維弧菌在不同培養(yǎng)條件，如溫度、鹽度、pH 等環(huán)境因子脅迫下 3 種基因表達(dá)量的變化，同時(shí)構(gòu)建 T6SS 相關(guān)基因缺失株，探究哈維弧菌 T6SS 功能及作用機(jī)制，為哈維弧菌的防控與治療提供理論基礎(chǔ)。圖 1-2 哈維弧菌 354 T6SS ?

Tab. 2-4 Homology analysis of amino acids of RbsB from V. harveyi 354 strain and othbacterial species菌種 Species同源性%Homology注冊(cè)號(hào)Accession N.o哈維弧菌（V. harveyi ATCC 33843） 100 % AIV07307.1歐文弧菌（V. owensii CAIM 1854） 100 % KIF46393.1氏弧菌（V. campbellii ATCC BAA-1116） 98 % AGU97393.1輪蟲弧菌（V. rotiferianus HM-10） 98 % OHY94262.1藻弧菌（V. alginolyticus ATCC 17749） 97 % GAD69766.1血弧菌（V. parahaemolyticus ATCC 17802） 97 % KKI09273.1需鈉弧菌（V. natriegens ATCC 14048） 97 % EPM40141.1貽貝弧菌（V. mytili CAIM 528） 96 % KIN10841.1創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus ATCC 33147） 92 % KGK71697.1遠(yuǎn)青弧菌（V. azureus NBRC 104587） 92 % GAD74752.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 高曉建;姚東瑞;孫晶晶;白雪松;~F一恒;張熒熒;畢可然;秦蕾;張曉君;;4株長牡蠣(Crassostrea gigas)致病性哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)鑒定及其毒力基因檢測(cè)[J];海洋湖沼通報(bào);2015年03期

2 曾德乾;馮娟;徐力文;蘇友祿;郭志勛;;海水養(yǎng)殖魚哈維弧菌分離株的耐藥譜型分析[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2015年01期

3 林海英;馬振寧;鄭允權(quán);郭養(yǎng)浩;唐鳳翔;;弧菌廣譜性外膜蛋白抗原篩選及其單抗的交叉免疫原性研究[J];福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年04期

4 趙璇;闞飆;崔志剛;梁未麗;;霍亂弧菌密度感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];疾病監(jiān)測(cè);2012年02期

5 張曉華;鐘英斌;陳吉祥;;哈維氏弧菌的生物學(xué)特性、流行病學(xué)及檢測(cè)技術(shù)[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年05期

6 石存斌;胡學(xué)峰;陳獻(xiàn)稿;李凱彬;吳淑勤;;兩株致病性哈維氏弧菌胞外產(chǎn)物的特性分析[J];水生生物學(xué)報(bào);2007年01期

7 劉萍萍,史兆興,陳宗德,黃留玉;周質(zhì)結(jié)合蛋白依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2005年03期

8 劉問,錢冬,楊國梁,張宇飛,王軍毅;南美白對(duì)蝦蝦苗淡化期間發(fā)光病病原研究[J];集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年04期

9 陳月忠,鐘碩良,周宸;成蝦發(fā)光病病原體的分離鑒定及防治技術(shù)研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年S1期

本文編號(hào)：2802824