【摘要】：白蠟蟲(chóng)Ericerus pela(Chavannes)二齡雄蟲(chóng)分泌的白蠟是用途廣泛的天然蠟酯,是多種蠟單酯的混合物。研究表明,蠟酯的合成是由脂酰輔酶A還原酶(fatty acyl-Co A reductase,FAR)將脂肪酸還原成脂肪醇,脂肪酸和脂肪醇在蠟酯合酶(wax synthase,WS)作用下酯化形成蠟酯。前期工作鑒定到了白蠟蟲(chóng)泌蠟候選基因far和ws,但關(guān)于far基因的功能等方面還缺少進(jìn)一步的研究。本研究在獲得白蠟蟲(chóng)far2基因c DNA ORF的基礎(chǔ)上,采用原核表達(dá)FAR2,為單克隆抗體制備提供蛋白;利用昆蟲(chóng)-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac baculovirus expression system)在Bm N家蠶細(xì)胞中表達(dá)FAR2,收集蛋白FAR2進(jìn)行體外酶活反應(yīng)分析,氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物;對(duì)蠟酯合成的另一關(guān)鍵酶基因進(jìn)行原核菌體表達(dá),低成本獲得大量ws基因的ds RNA(double-stranded RNA,ds RNA)。主要研究結(jié)果如下:(1)白蠟蟲(chóng)FAR2原核表達(dá)載體p ET-30a-e GFP/Epel FAR2成功構(gòu)建,Western blot鑒定FAR2表達(dá)成功,SDS-PAGE分析確定IPTG加入量0.8mmol·L-1、誘導(dǎo)時(shí)間8h為最佳誘導(dǎo)條件。(2)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)的重組質(zhì)粒p Fast-ie1-FAR2-e GFP成功構(gòu)建,重組Bacmid獲得后轉(zhuǎn)染Bm N家蠶細(xì)胞,可觀察到大量熒光。Western blot鑒定FAR2成功表達(dá),P2代病毒菌株感染細(xì)胞后于不同時(shí)間收集蛋白,其Western blot結(jié)果表明,細(xì)胞感染重組Bacmid后48h是最佳收集蛋白時(shí)間。(3)利用收集的白蠟蟲(chóng)FAR2對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度脂酰輔酶A進(jìn)行酶活反應(yīng),酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)GC分析,其結(jié)果顯示:白蠟蟲(chóng)FAR可將C28脂酰輔酶A還原為C28脂肪醇。(4)采用原核表達(dá)系統(tǒng)大量制備白蠟蟲(chóng)ws ds RNA。構(gòu)建白蠟蟲(chóng)L4440/Epel WS干擾載體,轉(zhuǎn)化后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得ws ds RNA的平均量1705ng·m L-1,電泳檢測(cè)拖尾現(xiàn)象不明顯、質(zhì)量較好。以上研究成功進(jìn)行FAR2原核表達(dá)、真核表達(dá)、酶活分析及ws ds RNA的獲得,為單克隆抗體制備、生化特性研究奠定了基礎(chǔ),ws ds RNA的體外表達(dá)對(duì)介殼蟲(chóng)防治具有一定意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S899.1
【圖文】：

即由超長(zhǎng)鏈脂肪酸產(chǎn)生醛、烷烴、仲醇及酮糖（圖1-1）。如擬南芥角質(zhì)層蠟大部分通過(guò)脫羰基途徑產(chǎn)生，只有小部分采用�；�原途徑（Klypina et al., 2008; Doan et al., 2009）。圖 1-1 植物擬南芥蠟酯合成途徑Fig.1-1 The The synthetic pathway of arabidopsis thaliana.細(xì)菌蠟酯合成與植物蠟酯合成的兩種方式都有差異，即合成時(shí)脂肪酸被還原成脂肪

技術(shù)路線(xiàn)圖

0a-eGFP 載體同時(shí)進(jìn)行 BamHI 和 HindIII 雙酶切結(jié)果如圖2-2A 和圖 2-2B。挑取 pET-30a-eGFP/EpelFAR2 陽(yáng)性單克隆酶切檢測(cè)如圖 2-2C，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)為正確。

【參考文獻(xiàn)】

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1 張雨良;黃啟星;張樹(shù)珍;王健華;伍蘇然;王俊剛;劉志昕;;細(xì)菌介導(dǎo)RNAi研究甘蔗二點(diǎn)螟蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CiHR3基因功能[J];應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2013年05期

2 楊璞;徐冬麗;陳曉鳴;劉魏魏;鞏中軍;胡艷紅;;蠟酯合成途徑及關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年07期

3 何晨柳;孔任秋;胡晗華;;產(chǎn)蠟酯聚球藻PCC7002的構(gòu)建[J];水生生物學(xué)報(bào);2010年06期

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1 孫濤;白蠟蟲(chóng)蠟酯合酶基因表達(dá)動(dòng)態(tài)和初步功能研究[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2017年

本文編號(hào)：2802063