【摘要】：中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.chineneis)屬石蒜科植物,為中國(guó)傳統(tǒng)十大名花之一,是福建省省花及漳州市市花。但近年來(lái)因其品種和花色單一等原因,產(chǎn)業(yè)發(fā)展陷入瓶頸。黃酮類化合物主要參與植物花色形成,其代謝途徑中一系列結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受R2R3-MYB等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本課題以中國(guó)水仙'金盞銀臺(tái)'為材料,從中國(guó)水仙鱗莖盤(pán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出兩條R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,分別命名為NtMYB5和NtMYB6,使用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆出這兩條基因的全長(zhǎng)序列,進(jìn)行序列分析;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在中國(guó)水仙不同成花時(shí)期以及不同組織部位的相對(duì)表達(dá)水平;構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)和煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究基因功能,并分析煙草瞬時(shí)表達(dá)葉片和轉(zhuǎn)基因植株中類黃酮代謝途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。研究結(jié)果將了解水仙類黃酮代謝途徑的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能,為進(jìn)一步了解類黃酮代謝途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1.利用RT-PCR技術(shù)從中國(guó)水仙花瓣中克隆得到NtMYB5基因編碼區(qū)序列,序列分析表明該基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)為681bp,編碼226個(gè)氨基酸。blast結(jié)果顯示NtMMYB5與茶樹(shù)CsMYB4a、柿子DkMYB13、大豆GmMYB5等相似度較高;蛋白多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)NtMYB5含有R2和R3結(jié)構(gòu)域和一個(gè)pdLNLD/ELxiG/s的氨基酸抑制基序;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果NtMYB5與花青素合成抑制因子聚為一類;通過(guò)對(duì)NtMYB5在中國(guó)水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NtMYA5表達(dá)量在花器官中較高,且隨花開(kāi)放表達(dá)量逐漸上升。2.利用RT-PCR和RACE技術(shù),從中國(guó)水仙鱗莖盤(pán)中克隆得到NtMYB6基因cDNA序列,序列分析顯示獲得的序列共1008bp,其中包含完整大小為750bp的開(kāi)放閱讀框,共編碼249個(gè)氨基酸;blast結(jié)果顯示NtMYB6與野草莓FvMYB12。通過(guò)蛋白多重序列比對(duì)分析顯示該基因含有R2和R3結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析顯示該基因同原花青素促進(jìn)因子親緣關(guān)系較近;NtMYB6基因在在鱗莖盤(pán)中的表達(dá)量最高。3.構(gòu)建pSAK277-NtMYB5和pSAK277-NtMYB6基因植物表達(dá)載體。首先進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn),分別將StMYB、NtMYB5+StMYB、NtMYB6、NtMYB6+StbHLH等組合注射煙草葉片,結(jié)果顯示NtMYB5顯著抑制花青素合成促進(jìn)因子StMYB的效果并下調(diào)煙草類黃酮代謝途徑中大部分結(jié)構(gòu)基因表達(dá);單獨(dú)注射NtMYB6基因僅上調(diào)煙草PAL和4CL基因表達(dá).4.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草中,NtMYB5和NtMMY6的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因植株花瓣顏色變淺,NtMYB5的效果更加明顯。與對(duì)照相比,NtMYB5轉(zhuǎn)基因植株花瓣中類黃酮代謝途徑大部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受到抑制,但是黃酮醇分支FLS的表達(dá)上調(diào);NtMYB6轉(zhuǎn)基因煙草花瓣中原花青素分支的LAR基因的表達(dá)上調(diào)。5.以上結(jié)果表明,NtMYB5是花青素合成的抑制因子,在中國(guó)水仙花中抑制花青素的合成;NtMYB6是原花青素合成的激活因子,可能通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵基因LAR的表達(dá)在中國(guó)水仙鱗莖盤(pán)中促進(jìn)原花青素的合成。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S682.21
【圖文】：

ＷＭＦ５６的克隆、序列分析和表達(dá)逡逑單子葉植物，目前對(duì)于單子葉植物的類黃酮合較少，本研究通過(guò)對(duì)中國(guó)水仙轉(zhuǎn)錄組分析，從中個(gè)Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ基因，分別命名為ＭＭ７５５和Ｍ碼區(qū)全長(zhǎng)序列，進(jìn)行序列分析并研宄它們?cè)谥袊?guó)中國(guó)水仙為漳州水仙‘金盞銀臺(tái)’品種，產(chǎn)自其開(kāi)花后用滅菌過(guò)的鑷子取出花絲和柱頭，將等組織用液氮速凍，保存在－８０°Ｃ冰箱中。逡逑

邐的克隆逡逑３．１．１邐ＲＮＡ質(zhì)量檢測(cè)逡逑提取中國(guó)水仙的ＲＮＡ經(jīng)１％凝膠電泳檢測(cè)后，跑膠結(jié)果如圖２－２所示。從圖逡逑中可以看到清晰的三條條帶，且２８ｓ條帶寬度和亮度均大于１８ｓ條帶，所提ＲＮＡ逡逑無(wú)ＤＮＡ污染且沒(méi)有彌散或拖帶現(xiàn)象，說(shuō)明該ＲＮＡ完整性好，未發(fā)生降解，可逡逑以進(jìn)行余下實(shí)驗(yàn)。逡逑經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)這些ＲＮＡ的ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ值在１．７５－１．８１范逡逑圍內(nèi)，ＯＤ２６０ｒａｎ／ＯＤ２８０ｎｍ值在２．０１－２．０７之間，總體符合后期實(shí)驗(yàn)要求。逡逑ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ接近１．８－２．０范圍，表示其沒(méi)有蛋白質(zhì)污染但有微量異硫氰逡逑酸胍殘存，逡逑ＢＢＢＨ逡逑圖２－２中國(guó)水仙ＲＮＡ電泳圖逡逑１Ｐ：花苞期的花瓣；２Ｐ：始花期的花瓣；３Ｐ：盛花期的花瓣；１Ｃ：花苞期的副冠；２Ｃ：始逡逑花期的副冠；３Ｃ：盛花期的副冠；Ｌ：葉片；Ｓ：淲片；Ｂ：淲堇盤(pán)逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉａｎｔｈ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｎａｒｃｉｓｓｕｓ逡逑Ｐ：邋Ｐｅｔ

３．１．２邋ＭＭ７５５保守區(qū)克隆與序列分析逡逑將中國(guó)水仙花瓣總ＲＮＡ逆轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后，用其作為模板，通過(guò)ＰＣＲ擴(kuò)逡逑增，產(chǎn)物跑膠獲得大小約為７００的條帶，如圖２－３所示。將條帶切下，經(jīng)過(guò)回收、逡逑連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中基因序列通過(guò)ＤＮＡＭＡＮ進(jìn)逡逑行比較，結(jié)果二者一致。該基因己在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中登陸，登陸號(hào)為：ＫＣ７６３９７３．１。逡逑７５０—逡逑ｔ邋？邋Ｈ．ｖ；逡逑■邋？逡逑圖２－３邋ＭＭＦＢ５基因擴(kuò)增產(chǎn)物逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＮｔＭＹＢ５邋ｆｒｏｍ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｎａｒｃｉｓｓｕｓ逡逑將ＭＭＦＢ５序列進(jìn)行ｂｌａｓｔ，結(jié)果顯示該基因序列同茶樹(shù)（Ｃａｍｅ／＆逡逑幻－？洲也尺丫７７４６７６．１）、柿子（＿0故／１；＇５廠位0年；；／７＾}?以尺丫８４９６０７．１）、大豆逡逑（ＧｗＭＹＢ＾ＧＶｙｃ／ｗｅ邋ｗａｘ邋ＮＭ—００１２４８７３３．２）、大丨肥花（ＤｖＭｙＢ２ＤａＭａ／）ｚ’《ｔｔａＭ逡逑ＡＢ６０１００４．１）、桑樹(shù)（ＭｚＭＴＲ？財(cái)Ｍｏｎ＾ａ／ｉａＫＹ６３６４０２．１）等物種的邋ＭＹＢ邋基因逡逑相似性分別為８３％、８３％、８０％、７９％、８０％。這些基因都是類黃酮代謝抑逡逑制因子．逡逑４５｜邐ＤｖＭＹＢ２逡逑１３｜１邐ＭａＭＹＢ３０８逡逑１２ｊ邋Ｉ邐ＶａＭＹＢ３０８逡逑３８邋Ｉ邐■邐ＣｓＭＹＢ４ａ逡逑＂邐９８ｌ邐ＤｋＭＹＢ１３逡逑５３邋邐ＣｃＭＹＢ３０８逡逑■邐２ｍＭＹＢ１１逡逑３０邐0ｇ邋Ｉ邐ｊ－邋ＣｐＭＹＢ４逡逑ｒａｌ—

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2801426