【摘要】：核苷類化合物是抗癌、抗病毒藥物的主要來源,阿糖鳥苷(ara-G)作為奈拉濱等的前藥,能夠有目的地抑制T細胞白血病的細胞活性,也是一種關(guān)鍵的抗癌類核苷類藥物。目前利用化學合成法工藝比較麻煩,使用某些化學試劑對人體和環(huán)境都可能造成一定的危害;而生物催化法在一定程度上可以解決上述問題,但也存在野生菌株酶產(chǎn)量較低而導致成本較高、同時一些產(chǎn)酶的微生物菌體本身可能具有致病性,從而阻礙了工業(yè)化生產(chǎn)。本文通過分子生物學技術(shù)對ara-G生物合成過程中所用關(guān)鍵酶進行克隆表達,以獲得催化反應(yīng)所用酶的高產(chǎn)基因工程菌,大幅度降低成本,為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。1.嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)與尿苷磷酸化酶基因(udp)工程菌的構(gòu)建:根據(jù)GenBank中的deoD與udp的序列設(shè)計引物,利用PCR擴增來源于埃希氏菌AEM0812菌株的deoD與udp基因,將基因片段分別與克隆載體pMD18-T連接得到重組質(zhì)粒pMD18-T-deoD和pMD18-T-udp,再將重組質(zhì)粒分別導入Escherichia coli DH5α獲得目的基因的克隆;然后將目的基因分別與表達載體pET-28a連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-deoD和pET-28a-udp,導入E.coli BL21(DE3),獲得工程菌菌株E.coli(deoD)、E.coli(udp);經(jīng)IPTG誘導表達,采用SDS-PAGE檢測表明目的基因表達成功。工程菌E.coli(deoD)與E.coli(udp)粗酶液酶活力分別是原始菌株的1.9倍與1.2倍。2.工程菌E.coli(deoD)或E.coli(udp)催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA):利用E.coli(deoD)或E.coli(udp)游離細胞或由其制備的粗酶液分別催化第一步反應(yīng),均能夠生成ara-DA,并且E.coli(deoD)與E.coli(udp)游離細胞轉(zhuǎn)化率比原始菌株AEM0812分別提高24.6%與22.3%,E.coli(deoD)與E.coli(udp)的粗酶液比原始菌株分別提高28.2%與2.0%;將E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游離細胞或粗酶液按照1:1的比例混合參與反應(yīng)時,轉(zhuǎn)化率相對于原始菌株AEM0812有明顯的提高,尤其是E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游離細胞的混合液效果最佳,轉(zhuǎn)化率是原始菌株的2.5倍。3.腺苷脫氨酶基因(add)工程菌的構(gòu)建:將來源于Pseudomonas aeruginosa TX16菌株的add基因克隆后導入E.coli BL21(DE3),得到含有重組質(zhì)粒pET-28a-add的工程菌E.coli(add),經(jīng)IPTG誘導后采用SDS-PAGE檢測,表明目的基因表達成功。酶活測定表明E.coli(add)粗酶液的酶活力是原始菌株P(guān).aeruginosa TX16的2.9倍。4.工程菌E.coli(add)催化合成ara-G:將E.coli(add)菌體直接加入到含有ara-DA的反應(yīng)體系中,HPLC檢驗結(jié)果表明E.coli(add)菌體游離細胞幾乎不能催化合成ara-G;將E.coli(add)菌體細胞破碎后制成粗酶液再進行反應(yīng),可以成功催化第二步反應(yīng)生成ara-G,而且轉(zhuǎn)化率比原始菌P.aeruginosa TX16有非常顯著的提高,其轉(zhuǎn)化率可達96.8%,是原始菌株的2.2倍。
【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;Q55
【圖文】：

圖 1-1 兩步法生成阿糖鳥苷的機理Fig.1-1 The mechanism of two-step enzymatic synthesis of guanine arabinosideUPase：尿嘧啶核苷磷酸化酶 PNPase：嘌呤核苷磷酸化酶 AMPDAase：腺苷脫氨酶在本實驗室前期工作過程中，曹倩等[83,84]采用埃希氏菌（Escherichia sp.）與銅假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa TX16）按照上述機理合成 ara-G； 同時為解決菌

圖 2-1 重組 DNA 構(gòu)建示意圖Fig 2-1 The construction of a schematic diagram of the reorganized DNA以 PNPase 為例（如圖 2.1），以大腸埃希氏菌 AEM0812 的基因組為模板，用 PCR量擴增出嘌呤核苷磷酸化酶基因，此過程用的是 LA Taq 酶，它屬于高保真酶，既保

圖 2-2 pMD18-T 和 pET-28a 載體圖譜Fig 2-2 The vector map of pMD18-T and pET-28a上述實驗實現(xiàn)了相關(guān)基因重組菌的成功構(gòu)建，證明目的基因已經(jīng)導入宿主菌，還要證明相應(yīng)的蛋白是否表達。因此，在相關(guān)基因工程菌構(gòu)建完成后，在 IPTG 的誘導

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4 明如鏡;Lewis Stevens;;家雞(Gallus domesticus)基因的結(jié)構(gòu)和組建[J];國外畜牧學(豬與禽);1987年06期

5 王震熙;林云富;王啟松;;胸腺素α_1基因的化學合成[J];科技通報;1987年03期

6 鄭錫榮;;能提高自身免疫力的抗癌藥物[J];國外醫(yī)學情報;1987年10期

7 吳芝清;宋陸鏵;;自制的五微升以下量程配液器[J];生物化學與生物物理進展;1987年01期

8 薛清剛;彭輝云;;分子遺傳學方法在研究細菌致病性中的應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1988年03期

9 羅進賢,周楨林,李鎮(zhèn)林,胡晉新;假單胞桿菌抗鎘基因的克隆[J];環(huán)境科學學報;1988年04期

10 郭秋鵬,胡美浩;北京鴨核DNA中β-珠蛋白基因的初步鑒定[J];北京大學學報(自然科學版);1988年06期

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8 甕巧云;邢繼紅;董金皋;;擬南芥抗病基因克隆的策略及利用[A];中國植物病理學第七屆青年學術(shù)討論會論文集[C];2005年

9 徐斌;范清林;桂向東;翟志敏;宋禮華;;BLyS的基因克隆及表達[A];中國生物工程學會第三次全國會員代表大會暨學術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

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6 劉磊;羊草eIF1基因的克隆及表達[D];大連工業(yè)大學;2012年

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本文編號：2801272