發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 05:45

【摘要】：甘藍(lán)型油菜從植物分類學(xué)上屬十字花科蕓薹屬(Brassica),是我國(guó)極其重要的油料、飼用作物。隨著社會(huì)化進(jìn)程不斷加深和經(jīng)濟(jì)的飛速增長(zhǎng),人們對(duì)植物油需求量急劇增加,這對(duì)甘藍(lán)型油菜生產(chǎn)提出了新的挑戰(zhàn)。由于其生長(zhǎng)過(guò)程中常常受到有效磷匱乏及草害影響,大大限制了它的發(fā)展。因此,為獲得高效磷素吸收利用同時(shí)兼具草甘膦抗性的甘藍(lán)型油菜新種質(zhì),本研究構(gòu)建了含有油菜葉綠體導(dǎo)肽eCTP、草甘膦抗性基因EPSPS、根部特異性啟動(dòng)子Pht1;2和植酸酶基因phyA的植物重組表達(dá)載體pC-NLTA。并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜‘隴上東’、‘1831R’和‘新疆21109’三個(gè)品種,對(duì)于確定轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜磷素吸收及草甘膦抗性具有一定的理論研究意義,同時(shí)也為獲得磷素高效吸收利用兼具草甘膦抗性的新型油菜種質(zhì)資源提供研究的理論依據(jù)和參考。本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:1.運(yùn)用生物信息學(xué)軟件:TargetP 1.1 Server和ChloroP 1.1 Server預(yù)測(cè)了油菜rbcS的亞細(xì)胞定位,同時(shí)也得到了其編碼氨基酸序列中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和剪切位點(diǎn),分析整理得到了理想的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列并命名為eCTP;2.以質(zhì)粒pMD-nos為模板亞克隆得到nos終止子,以甘藍(lán)型油菜RG2 cDNA為模板克隆得到葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽eCTP,以質(zhì)粒pTOPO-EPSPS為模板亞克隆得到EPSPS基因,以提取的野生型擬南芥的DNA為模板克隆得到根特異性啟動(dòng)子Pht1;2,以質(zhì)粒PGA1611-E-PhpAO為模板亞克隆得到phyA基因,采用重疊PCR方法將葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽eCTP與EPSPS基因融合,得到了融合片段L;3.以pCEPSP為基礎(chǔ)載體,采用酶切連接的方法,依次插入nos終止子、融合片段L、根特異性啟動(dòng)子Pht1;2及植酸酶基因phyA,最終構(gòu)建獲得了植物重組表達(dá)載體pC-NLTA,并利用凍融轉(zhuǎn)化法將其整合到了農(nóng)桿菌LBA4404中;4.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化三個(gè)品種甘藍(lán)型油菜(‘新疆21109’、‘1831R’和‘隴上東’),經(jīng)過(guò)草甘膦抗性篩選和PCR擴(kuò)增檢測(cè),分別得到2株‘新疆21109’陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株、2株‘1831R’陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株和1株‘隴上東’陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株;5.利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)T0代陽(yáng)性植株內(nèi)各基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,與對(duì)照植株相比,陽(yáng)性植株內(nèi)植酸酶基因phyA和草甘膦抗性基因EPSPS的表達(dá)量均得到顯著提高。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S565.4
【圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)位論文的克隆的亞克隆含 nos 終止子）質(zhì)粒為模板，用 N1/N（圖 4A），回收目的基因并與 pMD19提取重組質(zhì)粒，并用 Hind Ⅲ和 PstⅠ雙圖 4B），將酶切結(jié)果合適的重組載體測(cè)序結(jié)果表明，與 GenBank 中注冊(cè)的說(shuō)明已經(jīng)成功亞克隆到 nos 終止子。

因的亞克隆PS（含 CP4 EPSPS）質(zhì)粒為模板，用 E1/E2帶（圖 6A），回收目的基因并與 pMD1中。提取重組質(zhì)粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ雙適（圖 6B），將酶切結(jié)果合適的重組載體命。測(cè)序結(jié)果表明，與 GenBank 中注冊(cè)的完全一致（見(jiàn)附表 1.3），說(shuō)明已經(jīng)成功亞克A BTP 的 PCR 產(chǎn)物及重組子 pMD-eCTP 的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)ication of eCTPand restrict digestion analysis of recombipMD-eCTPA-1、2、3 eCTP的PCR產(chǎn)物；B-1、2 pMD-eCTP經(jīng)KpnⅠ和 XhoⅠ雙r；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by Kpn

基因的亞克隆-EPSPS（含 CP4 EPSPS）質(zhì)粒為模板，用 E1/E的條帶（圖 6A），回收目的基因并與 pMD細(xì)胞中。提取重組質(zhì)粒，用 EcoRⅠ和 XhoⅠ小合適（圖 6B），將酶切結(jié)果合適的重組載體序。測(cè)序結(jié)果表明，與 GenBank 中注冊(cè)的列完全一致（見(jiàn)附表 1.3），說(shuō)明已經(jīng)成功亞A B 5 eCTP 的 PCR 產(chǎn)物及重組子 pMD-eCTP 的酶切產(chǎn)物電泳mplification of eCTPand restrict digestion analysis of recombpMD-eCTParker；A-1、2、3 eCTP的PCR產(chǎn)物；B-1、2 pMD-eCTP經(jīng)KpnⅠ和 XhoⅠMarker；A-1,2,3 PCR product of eCTP; B-1,2 pMD-eCTP was digested by K

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2800337