【摘要】：手性環(huán)氧化物和鄰二醇是合成手性化合物的重要中間體,在功能材料、醫(yī)藥和農(nóng)藥等的合成中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋環(huán)氧化物的選擇性開(kāi)環(huán)生成相應(yīng)的手性鄰二醇或選擇性保留手性環(huán)氧化物。區(qū)域選擇性高且互補(bǔ)的單一EH催化外消旋環(huán)氧化物對(duì)映歸一性水解是制備手性鄰二醇的理想途徑,但目前僅有少數(shù)EHs具有此特性。本論文從菜豆(Phaseolus vulgaris)基因組中擴(kuò)增了一種編碼PvEH3的基因pveh3,并將其在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá);采用定點(diǎn)和迭代突變技術(shù)對(duì)PvEH3進(jìn)行分子改造,以獲得高活力和高區(qū)域選擇性的PvEH3突變體;通過(guò)構(gòu)建雙相催化體系解除底物對(duì)最優(yōu)突變體PvEH3~(G170E/F187L/P237L)的抑制作用。以菜豆總RNA為模板,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增了一條新型環(huán)氧化物水解酶的編碼基因pveh3,其長(zhǎng)度為957 bp,編碼318個(gè)氨基酸。一級(jí)和三維結(jié)構(gòu)分析表明PvEH3屬于α/β水解酶超家族,其催化三聯(lián)體為D101-H297-D262,兩個(gè)保守質(zhì)子供體為Y150和Y232。SDS-PAGE結(jié)果顯示PvEH3的表觀分子量為36.1 kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化對(duì)氯環(huán)氧苯乙烷(pCSO)的對(duì)映歸一性水解,產(chǎn)物(R)-對(duì)氯苯乙二醇(pCPED)的對(duì)映體過(guò)量值(ee_p)為85.1%。PvEH3對(duì)(S)-和(R)-pCSO的區(qū)域選擇性系數(shù)α_S和β_R分別為87.0%和98.0%。通過(guò)鎳離子親和層析柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,PvEH3的比活力為1.36 U·mg~(-1),針對(duì)pCSO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)K_m和k_(cat)/K_m分別為6.60mM和0.583 mM~(-1)·s~(-1)�；赑vEH3與(R)-pCSO的分子對(duì)接模擬分析和與植物EHs的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果對(duì)PvEH3的7個(gè)非保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。其中突變體PvEH3~(G170E)全細(xì)胞比活力最高為12.86 U·g~(-1) wcw,是PvEH3的3.7倍;PvEH3~(F187L)和PvEH3~(P237L)對(duì)映歸一性最好,ee_p分別從PvEH3的85.1%提高至90.0%和91.2%。隨后經(jīng)組合點(diǎn)突變和迭代飽和突變獲得最優(yōu)突變體PvEH3~(G170E/F187L/P237L),其全細(xì)胞比活力從3.45提高至20.31 U·g~(-1)wcw,區(qū)域選擇性系數(shù)α_S和β_R分別為95.0%和98.0%。純化后PvEH3~(G170E/F187L/P237L)催化pCSO的K_m和k_(cat)/K_m分別為4.86 mM和1.81 mM~(-1)·s~(-1)。在環(huán)己烷的體積比為5%、全細(xì)胞催化劑與底物的重量比為12:1(w/w)的雙相催化體系中,PvEH3~(G170E/F187L/P237L)全細(xì)胞催化200 mM pCSO對(duì)映歸一性水解5.5 h后,產(chǎn)物(R)-pCPED的ee_p和產(chǎn)率分別為96.1%和98.0%,時(shí)空產(chǎn)率STY為6.16 g·L~(-1)·h~(-1)。底物譜分析表明,PvEH3能催化環(huán)氧苯乙烷(SO)及其4種衍生物的水解,取代基的類型和位置均影響其活力和對(duì)映歸一性,PvEH3~(G170E/F187L/P237L)對(duì)5種底物的催化活力較PvEH3均有提高,是PvEH3的2.1~5.9倍。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2
【圖文】：

第一章 緒論1.1 環(huán)氧化物水解酶環(huán)氧化物水解酶 (epoxide hydrolases, EHs, EC 3.3.2-) 能催化外消旋環(huán)氧化物的擇性開(kāi)環(huán)，通過(guò)加成一個(gè)水分子生成相應(yīng)的手性鄰二醇或選擇性保留手性環(huán)氧化物[1]EHs 催化外消旋環(huán)氧化物水解主要有水解動(dòng)力學(xué)拆分和對(duì)映歸一性水解兩種形式。EH水解動(dòng)力學(xué)拆分外消旋環(huán)氧化物時(shí)優(yōu)先催化其中一種對(duì)映體水解從而保留另一種對(duì)體，理論產(chǎn)率為 50% (圖 1-1 (a))。對(duì)映選擇性的高低用對(duì)映選擇率 (enantiomeric ratio, 來(lái)評(píng)價(jià)，E 值越高對(duì)映選擇性越好，保留的對(duì)映體的純度用底物對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric exess, ees) 表示[2]。EHs 對(duì)映歸一性水解外消旋環(huán)氧化物時(shí)對(duì)兩種對(duì)映體有互補(bǔ)的區(qū)域選擇性，即攻擊一種對(duì)映體的 β-碳原子而攻擊另一種對(duì)映體的 α-碳原子從而得到理論產(chǎn)率為 100%的手性鄰二醇，其純度用 eep表示，eep越高說(shuō)明該酶催化底物的對(duì)映歸一性越好 (圖 1-1 (b))[3]。

兩大結(jié)構(gòu)域分別為核心結(jié)構(gòu)域和蓋子結(jié)構(gòu)域：核心結(jié)構(gòu)域由 α 螺旋和 β 折疊組成，包括一段 core loop 和催化三聯(lián)體；蓋子結(jié)構(gòu)域位于核心結(jié)構(gòu)域上方，主要由 α 螺旋組成，包括一段 cap loop 和兩個(gè)保守質(zhì)子供體[9,10]；NC loop 起著連接兩大結(jié)構(gòu)域的功能[11]。A.niger EH 也屬于 α/β 水解酶超家族，其不對(duì)稱晶胞為兩個(gè) 44 kDa 的亞基，每一個(gè)亞基又可以分為 3 個(gè)部分，α/β 核心結(jié)構(gòu)域、蓋子結(jié)構(gòu)域和 N-末端錨定結(jié)構(gòu)域 (N-termmalmeander)[12]。α/β 核心結(jié)構(gòu)域包括包括催化三聯(lián)體 D192-H374-D348，蓋子結(jié)構(gòu)域包括 6個(gè)覆蓋在催化三聯(lián)體上方的 α 螺旋 (圖 1-2 (b))。(2) 來(lái)源于人類的 LTA4H 屬于白三烯A4水解酶，三維結(jié)構(gòu)如圖 1-2 (c) 所示，由 N 端結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和 C 端結(jié)構(gòu)域 3 部分組成[13]。其 N 段結(jié)構(gòu)域由 7 個(gè) β 折疊股和 2 個(gè) β 折疊片 (4 個(gè) β 折疊股) 組成，催化結(jié)構(gòu)域位于N端結(jié)構(gòu)域下方由α螺旋葉和α螺旋/β折疊混合葉組成，無(wú)規(guī)則卷曲Pro-richloop 連接催化結(jié)構(gòu)域和 C 端結(jié)構(gòu)域。(3) 紅串紅球菌 (R. erythropolis) EH 屬于檸檬烯-1,2-EHs，是典型非 α/β 水解酶超家族的 EH (圖 1-2 (d))，每個(gè)亞基由 6 個(gè) β 折疊片和 α螺旋組成，且 β 折疊片彼此垂直[14]。催化三聯(lián)體 D101-R99-D132 位于由 β 折疊片和 3個(gè) N 末端 α 螺旋組成的口袋中。

圖 1-3 α/β 水解酶超家族 EHs 催化機(jī)制Fig. 1-3 Catalytic mechanism of α/β-fold superfamily EHs白三烯 A4水解酶的催化機(jī)理是 Zn2+作為 Lwies 介導(dǎo)與 His 和 Glu 結(jié)合催化環(huán)開(kāi)環(huán)反應(yīng)[11, 17]。檸檬烯 1,2-EHs 在催化過(guò)程中不形成乙二醇-單酯-酶中間體復(fù)直接通過(guò)一步反應(yīng)來(lái)催化底物開(kāi)環(huán)：Asp 在 Asn 和 Tyr 的輔助下激活水分子，分子直接親核攻擊環(huán)氧環(huán)中的一個(gè)碳原子，與此同時(shí)，Asp 通過(guò)給環(huán)氧環(huán)的氧質(zhì)子來(lái)將其激活，因此，鄰二醇通過(guò)推挽式的方式一步獲得。產(chǎn)物釋放以后， Arg 的協(xié)助下將質(zhì)子傳遞給另外一個(gè) Asp，使酶恢復(fù)最初始狀態(tài)。3 EHs 基因的挖掘1963 年 Hartmann 和 Tulloch 在銹菌的孢子中發(fā)現(xiàn)可以水解順式和蘇式-9,10-環(huán)的 EH[12, 19]。1980~1982 年，科研工作者陸續(xù)在真菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了能水解各環(huán)氧化物的 EHs，從此對(duì)環(huán)氧化物水解酶底物特異性和立體選擇性的研究得到展[20, 21]。植物來(lái)源的 EHs 在角質(zhì)素、芳香劑和抗真菌化合物的合成中起著重[22]。Stapleton 等在土豆 (Solanum tuberosum) 中克隆和表達(dá)了一種可溶性的 St

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本文編號(hào)：2800108