【摘要】：亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)分布于荒漠和半荒漠地區(qū),生境主要在胡楊林和灌叢,宿主為牛、羊、馬、野豬和雙峰駝,也侵襲人。亞洲璃眼蜱可傳播新疆出血熱、Q熱、環(huán)形泰勒蟲病等多種自然疫源性疾病。防御素是一種抗菌多肽,在機體先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,研究蜱源防御素對探索蜱與病原體之間的關系、開發(fā)抗蜱藥物和控制蜱傳疾病具有重要意義。本研究以亞洲璃眼蜱為研究對象,提取總RNA后利用Clontech建庫試劑盒構(gòu)建cDNA文庫,利用PCR技術(shù)進行分子克隆,得到五條防御素基因,分別命名為Ha-defensin-1、Ha-defensin-2、Ha-defensin-3、Ha-defensin-4和Ha-defensin-5。開放閱讀框大小分別為219bp、222bp、222bp、207bp、和222bp,編碼氨基酸個數(shù)為73、74、74、69和74,等電點分別為9.08、9.54、9.89、5.53和9.99。與NCBI發(fā)布的其他蜱源防御素的氨基酸序列相似性范圍為53%~82%。對Ha-defensin-1和Ha-defensin-2進行原核表達并研究重組蛋白的功能。分別將Ha-defensin-1和Ha-defensin-2連入表達載體pET-32(a+)轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)感受態(tài)細胞中表達,并進行表達條件的摸索和優(yōu)化,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白大小約25kDa,與預測大小一致。利用Real-time PCR技術(shù)對Ha-defensin-1和Ha-defensin-2的表達情況進行初步分析,結(jié)果顯示Ha-defensin-1和Ha-defensin-2基因的表達具有時期、組織和不同菌脅迫時的特異性。通過抑菌圈實驗、最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定,結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有抑菌活性,但存在差異性�？寡趸瘜嶒灲Y(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2對ABTS·+和DPPH·自由基具有一定的清除能力。溶血活性實驗結(jié)果顯示重組蛋白pET-32(a+)-Ha-defensin-1和pET-32(a+)-Ha-defensin-2在86.8μM和93.8μM濃度下的溶血率分別為5.58%和6.39%。對亞洲璃眼蜱防御素生物學功能的研究為揭示蜱類先天免疫機制和開發(fā)新型生物制劑奠定了基礎。
【學位授予單位】：河北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.746

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本文編號：2799969