【摘要】：目的:利用毒素組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組、蛋白組)和分離鑒定技術(shù)(分子篩、高效液相、質(zhì)譜)構(gòu)建陜西來源的野生東亞鉗蝎毒素多肽信息資源庫;并基于該資源庫結(jié)合東亞鉗蝎天然蝎毒多肽分離純化的結(jié)果,篩選出新型東亞鉗蝎Na+通道毒素;對(duì)發(fā)現(xiàn)的新型東亞鉗蝎Na+通道毒素進(jìn)行性質(zhì)鑒定和初步活性研究。方法:(1)構(gòu)建陜西來源的東亞鉗蝎的轉(zhuǎn)錄組和cDNA文庫,得到的unigene經(jīng)識(shí)別、拼接、比對(duì)后得到同源基因,再利用Blast進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì),進(jìn)行基因功能分類注釋,分析其生物學(xué)功能,篩選出可能為毒素的基因。(2)構(gòu)建并分析陜西來源的東亞鉗蝎蛋白組學(xué)數(shù)據(jù),利用iTRAQ技術(shù)對(duì)東亞鉗蝎蝎毒素進(jìn)行標(biāo)記和定量,通過SCX分離、液相串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。(3)利用Sephadex G50凝膠過濾色譜和高效液相儀進(jìn)行東亞鉗蝎天然蝎毒多肽的逐級(jí)分離,結(jié)合電生理活性篩選具有活性的毒素蛋白單組份,并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,利用組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合東亞鉗蝎天然蝎毒多肽的分離鑒定結(jié)果篩選得到新Na+通道毒素BmKNaTx12。(4)利用與BmKNaTx12具有較高同源性的Cn12進(jìn)行同源建模,選取打分最高的模型得到BmKNaTx12的結(jié)構(gòu),并進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。構(gòu)建BmKNaTx12重組表達(dá)系統(tǒng),通過Western blot技術(shù)確定重組蛋白最佳表達(dá)時(shí)間,并在HEK293細(xì)胞中表達(dá),經(jīng)蛋白A親和層析后獲得重組蛋白,利用SDS-PAGE凝膠電泳和高效液相進(jìn)行鑒定。(5)利用全細(xì)胞膜片鉗檢測rBmKNaTx12對(duì)hNav1.7通道和rNav1.8通道電流的影響。結(jié)果:(1)構(gòu)建的均一化cDNA文庫容量為1.6×106cfu/ml,重組率為93.75%,插入序列平均長度大于750bp,得到36665條unigene,經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對(duì)得到2231條同源基因,其中毒素相關(guān)基因超過50%。轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行基因功能注釋后,約有8%的序列疑似新Na+通道毒素。(2)蛋白質(zhì)組通過液相串聯(lián)質(zhì)譜經(jīng)Mascot分析,得到3382張unique譜圖,鑒定到245個(gè)蛋白。(3)陜西來源的東亞鉗蝎天然蝎毒多肽經(jīng)凝膠過濾色譜和高效液相分離后共鑒定出49個(gè)單組份蛋白。經(jīng)組學(xué)數(shù)據(jù)篩選鑒定出19條全新的毒素多肽序列,其中有9條疑似新型東亞鉗蝎Na+通道毒素,結(jié)合組學(xué)數(shù)據(jù)和天然蝎毒多肽的分離鑒定結(jié)果篩選得到新型東亞鉗蝎Na+通道毒素BmKNaTx12。(4)BmKNaTx12與Cn12的同源相似性為35%,利用Cn12的結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行同源建模,并對(duì)BmKNaTx12進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。成功構(gòu)建BmKNaTx12的重組表達(dá)載體,并通過HEK293細(xì)胞成功表達(dá),ProteinA親和純化柱純化后得到濃度為0.12mg/ml的重組蛋白溶液共30ml。SDS-PAGE凝膠電泳顯示其大小約40kD,高效液相峰圖單一,說明重組蛋白的純度較高。(5)1μmol/LrBmKNaTx12能增大20%hNav1.7峰電流,不影響TTX-R的rNav1.8電流,結(jié)果顯示rBmKNaTx12能夠顯著激活hNav1.7電流。結(jié)論:利用毒素組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組、蛋白組)和分離鑒定技術(shù)構(gòu)建陜西來源的野生東亞鉗蝎毒素多肽信息資源庫;發(fā)現(xiàn)并鑒定了以BmKNaTx12為代表的幾種新型Na+通道毒素;成功對(duì)BmKNaTx12進(jìn)行了重組表達(dá),BmKNaTx12明顯增大hNav1.7電流。以BmKNaTx12為模板建立新型Na+通道毒素的從分離鑒定到重組制備的工藝,為其后續(xù)的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q51;Q78

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本文編號(hào)：2799911