【摘要】：目的以三陰性乳腺癌親代敏感細(xì)胞(MDA-MB-231/S)及其同系構(gòu)建的多西紫杉醇耐藥細(xì)胞(Docetaxel,Doc;MDA-MB-231/Doc)為研究對象,探討 miR-21(MicroRNA-21,miR-21)對MARCKS基因表達(dá)的調(diào)控及其與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株多西紫杉醇耐藥的潛在關(guān)系,為乳腺癌耐藥逆轉(zhuǎn)治療尋找靶點(diǎn)。方法通過基因芯片篩選到miR-21在親代敏感細(xì)胞株(MDA-MB-231/S)與多西紫杉醇耐藥細(xì)胞株(MDA-MB-231/Doc)中存在差異表達(dá),并經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)方法獲得驗(yàn)證;分別合成miR-21模擬物(mimics)和抑制物(inhibitors),經(jīng)轉(zhuǎn)染對上述敏感和耐藥細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)性試驗(yàn)研究,觀察這些細(xì)胞受干預(yù)后miR-21表達(dá)及其藥物敏感性的變化;通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-21的靶基因,分析miR-21與MARCKS基因的靶向關(guān)系;采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證miR-21表達(dá)水平的變化通過靶向MARCKS基因?qū)θ幮匀橄侔┘?xì)胞多西紫杉醇耐藥性的影響。結(jié)果1、miRNA芯片分析表明,與MDA-MB-231/S相比,miR-21在MDA-MB-231/Doc中的表達(dá)水平明顯升高,差異為(2.03±0.06)倍(P0.05)。2、與陰性對照組相比,敏感細(xì)胞(MDA-MB-231/S)轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后miR-21表達(dá)水平明顯增高(22.26±0.07)倍(P0.05),同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)為IC50(導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的Doc藥物濃度)明顯增加、Doc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯降低。耐藥細(xì)胞(MDA-MB-231/Doc)轉(zhuǎn)染 miR-21 inhibitors 后 miR-21 表達(dá)水平明顯下調(diào)(是陰性對照組的0.36±0.03倍;P0.05),同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)為IC50明顯降低、Doc誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯增高。3、PicTar、TargetScan 和 miRDB 預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn) MARCKS 為 miR-21 的特異性靶基因。進(jìn)一步研究證實(shí)miR-21與MARCKS基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān):轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的MDA-MB-231/S細(xì)胞中MARCKS mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降,耐藥性增強(qiáng);轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitors的MDA-MB-231/Doc細(xì)胞中MARCKS mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高,耐藥性逆轉(zhuǎn)。結(jié)論1、miR-21在乳腺癌耐藥細(xì)胞(MDA-MB-231/Doc)中的表達(dá)明顯高于其敏感細(xì)胞(MDA-MB-231/S)。2、體外導(dǎo)入miR-21模擬物以及抑制物后發(fā)現(xiàn),miR-21表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞對多西紫杉醇的耐藥呈正相關(guān),確認(rèn)miR-21為耐藥相關(guān)miRNAs。3、生物信息結(jié)果顯示MARCKS是miR-21的特異性靶基因,miR-21與MARCKS基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。4、miR-21可能通過靶向調(diào)節(jié)MARCKS基因影響三陰性乳腺癌細(xì)胞對多西紫杉醇化療的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

Ｆｉｇ．ｌ邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｍｉｒ－２１邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋Ｄｏｃ逡逑４．５邋ｍｉＲ－２１對預(yù)測靶基因的影響逡逑ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／Ｓ轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－２１ｍｉｍｉｃｓ后，ｍｉＲ－２１表達(dá)量明顯上調(diào)，結(jié)果見逡逑圖２，針對ＭＡＲＣＫＳ的基因表達(dá)分析顯示：其ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)水平均下降，逡逑分別是陰性對照的（０．３６２士０．０７６）倍和（０．３８６土０．０２０）倍（Ｐ＜０．０５）；另一方面，逡逑ＭＤＡ－ＭＢ－２３１／Ｄｏｃ邋轉(zhuǎn)染邋ｍｉＲ－２ｌ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ邋后，ｍｉＲ－２１邋表達(dá)量明顯下調(diào)，ＭＡＲＣＫＳ逡逑基因表達(dá)分析顯示：其ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，分別是陰性對照組的逡逑（３．５６４士０．３３６）倍和（２．０１９士０．２６８）倍（Ｐ＜０．０５）；陰性對照和空白對照組間均無差異逡逑（？＞０．０５）。通過預(yù)測分析，抑癌基因ＭＡＲＣＫＳ可能為ｍｉＲ－２１的特異性靶基因。逡逑

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本文編號：2799667