【摘要】：研究背景阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病,該病的主要表現(xiàn)為全腦不可逆性記憶功能損害,是公認(rèn)的一種難治性疾病,其發(fā)病率和年齡的增長(zhǎng)密切相關(guān)。AD的主要病理特征為細(xì)胞外β淀粉蛋白(β-amloid,Aβ)沉積和細(xì)胞內(nèi)過量的Tau蛋白磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurogibrillary tangles,NFTs),從而導(dǎo)致突觸功能障礙和神經(jīng)元丟失等。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞中一個(gè)至關(guān)重要的過程,一旦囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)不能正常工作,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有害蛋白蓄積,蛋白溶酶體降解過程紊亂,最終導(dǎo)致認(rèn)知損害等神經(jīng)退行性疾病。研究目的本研究采用CRISPR/cas 9技術(shù)構(gòu)建C57BL/6J背景的Vps4b+/-基因敲除小鼠模型,通過對(duì)小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn),評(píng)估基因敲除小鼠情感及認(rèn)知能力的變化;進(jìn)一步通過蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn),確定基因敲除后與AD通路有關(guān),通過小鼠腦組織AD相關(guān)蛋白表達(dá)的變化的驗(yàn)證,以及對(duì)神經(jīng)元及突觸可塑性等影響研究,以闡明Vps4b在小鼠認(rèn)知損中扮演的角色及其具體致病機(jī)制。材料與方法通過小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探索小鼠情緒及認(rèn)知能力的變化。采用iTRAQ蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)Vps4b+/-小鼠腦組織蛋白差異表達(dá)情況,免疫印記技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白;采用免疫熒光及免疫印記實(shí)驗(yàn),探討老年小鼠腦組織蛋白差異表達(dá)情況;進(jìn)一步采用尼氏染色、高爾基染色探索小鼠神經(jīng)元數(shù)目及突觸可塑性變化;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)VPS4B染色質(zhì)相互區(qū)域。透射電鏡觀察腦組織多泡體、自噬體、溶酶體結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、黑白箱實(shí)驗(yàn)、高架迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Vps4b+/-較正常小鼠情緒更焦慮;三箱社交行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn),水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Vps4b+/-,認(rèn)知及記憶能力受損。iTRAQ蛋白組學(xué)結(jié)果顯示Vps4b+/-小鼠AD相關(guān)通路蛋白表達(dá)明顯上升,WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果;免疫熒光及WB實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)顯示Vps4b+/-小鼠腦組織中App,Aβ40,Aβ42,P-Tau表達(dá)增多,Map2,Syp,Bc12表達(dá)減少;病理結(jié)果顯示Vps4b+/-小鼠神經(jīng)元數(shù)目減少,神經(jīng)元分枝及樹突棘較正常小鼠顯著減少;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)人的大腦皮層中VPS4B與BCL2染色質(zhì)區(qū)域存在相互作用。透射電鏡顯性Vps4b+/-小鼠腦組織內(nèi)囊泡運(yùn)輸受損,自噬體、溶酶體明顯增多。結(jié)論Vps4b+/-基因敲除雜合子小鼠認(rèn)知能力受損,其致病機(jī)制為Vps4b敲降引起App,Aβ40,Aβ42,P-Tau表達(dá)增多,Map2,Syp表達(dá)減少,從而導(dǎo)致小鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)目及結(jié)構(gòu)受損,小鼠表現(xiàn)為記憶及認(rèn)知功能受損。同時(shí)小鼠腦組織內(nèi)囊泡運(yùn)輸受損,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)蓄積,也可導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。研究背景和目的成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)是一種參與釉質(zhì)形成的蛋白質(zhì),并通過上皮間充質(zhì)相互作用參與牙齒發(fā)育早期牙本質(zhì)的形成。AMBN是釉質(zhì)基質(zhì)蛋白中含量?jī)H次于釉原蛋白,在釉質(zhì)形成過程中發(fā)揮重要的作用,AMBN突變可導(dǎo)致遺傳性釉質(zhì)發(fā)育不全,但AMBN突變導(dǎo)致牙本質(zhì)異常至今尚未見報(bào)導(dǎo)。材料與方法以一個(gè)中國(guó)廣東湛江的牙齒發(fā)育異常家系成員為研究對(duì)象,采集家系成員外周血和臨床檢查資料。采用Micro-CT及掃描電鏡對(duì)脫落患牙超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用全外顯子測(cè)序、Sanger測(cè)序技術(shù)以及家系共分離等方法,確定致病基因與突變位點(diǎn)并進(jìn)行人群突變率篩查。采用Polyphen-2和I-TASSER分別對(duì)AMBN蛋白突變位點(diǎn)保守性和突變蛋白的三維構(gòu)象變化情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。轉(zhuǎn)染AMBN野生型和突變型真核表達(dá)載體至人源的HEK-293T細(xì)胞,比較野生型與突變型融合蛋白在細(xì)胞中亞細(xì)胞定位的差異,檢測(cè)突變型AMBN在HGF細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞中mRNA和AMBN蛋白與野生型表達(dá)水平的差異。結(jié)果根據(jù)家系中患者情況我們繪制了該家系圖譜,確定其為常染色體顯性遺傳牙釉質(zhì)發(fā)育不全及牙本質(zhì)發(fā)育異常疾病,可同時(shí)累及恒牙及乳牙。Micro-CT結(jié)果顯示,患牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)密度均比正常牙齒較低,髓腔內(nèi)可見高密度鈣化的髓石。SEM結(jié)果表明患牙釉質(zhì)釉柱排列稀疏,偶爾可見無結(jié)構(gòu)鈣化區(qū)域,釉牙本質(zhì)界缺少連續(xù)貝殼狀的曲線,呈間隙增寬的直線狀,牙本質(zhì)小管分布不均,大小不一。對(duì)家系成員全基因組外顯子測(cè)序、Sanger測(cè)序、STR連鎖分析結(jié)果顯示,家系患病成員AMBN基因13號(hào)外顯子(c.1069CT),致病突變家系出現(xiàn)共分離,且人群中未發(fā)現(xiàn)該突變。蛋白結(jié)構(gòu)及有害性預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示位于AMBN蛋白357位點(diǎn)在多個(gè)物種中為保高度守位點(diǎn),突變后蛋白三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,且為有害性改變。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示野生型及突變型AMBN融合蛋白均定位于胞漿中。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示突變AMBN基因mRNA相對(duì)表達(dá)量與野生型無差異,但突變后蛋白表達(dá)水平顯著高于野生型蛋白(P0.001)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)AMBN(c.1069CT)突變導(dǎo)致牙齒釉質(zhì)發(fā)育不全合并牙本質(zhì)發(fā)育異常。牙齒礦化不良,超微結(jié)構(gòu)改變。新的突變位點(diǎn)在AMBN蛋白序列中具有高度保守性,導(dǎo)致蛋白三維構(gòu)象發(fā)生改變,為有害突變,突變后蛋白表達(dá)量增加。本研究表明AMBN對(duì)牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)發(fā)育具有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16
【圖文】：

圖１－１邋ＥＳＣＲＴ復(fù)合物及的組成和相互作用［２６］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＳＣＲＴ邋ｍａｃｈｉｎｅｒｙ逡逑１．３邋Ｖｐｓ４結(jié)構(gòu)及相互作用蛋白逡逑Ｖｐｓ４邋是邋ＡＡＡ（ＡＴＰａｓｅｓ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｖｅｒｓｅｅｌｌｕｌａｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）邋ＡＴＰ邋酶家族的逡逑成員，具有尚度保守的蛋白質(zhì)序列、Ｓ間結(jié)構(gòu)，在ＭＶＢ途徑、胞質(zhì)分裂、病逡逑毒出芽中都發(fā)揮重要作用。Ｖｐｓ４的空間結(jié)構(gòu)［２７，２８１：邋Ｎ端為ＭＩＴ結(jié)構(gòu)域，其上逡逑下兩面均能與含有ＭＩＭ的蛋白質(zhì)結(jié)合；Ｃ端為保守的�。崧菪ǎ缅澹瑁澹欤椋恢虚g逡逑是ＡＡＡ結(jié)構(gòu)域，包括一大一小兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，二者之間能結(jié)合ＡＴＰ；邋Ｖｐｓ４特逡逑有的�。衅瑢咏Y(jié)構(gòu)是在�。粒粒羴喗Y(jié)構(gòu)中，稱為Ｐ結(jié)構(gòu)域，其側(cè)面能與Ｖｔａｌ邋Ｃ端逡逑的ＶＳＬ（Ｖｔａｌ、ＳＢＰ１、ＬＩＰ５）結(jié)構(gòu)域結(jié)合；Ｖｐｓ４結(jié)合ＡＴＰ后可形成雙層環(huán)狀的逡逑尾對(duì)尾式的１２聚體，每層組成一個(gè)６元環(huán)，兩層之間含有一中間孔道；卩結(jié)構(gòu)逡逑

邐ＨＳＣＲＴ－ＩＩ邐ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ逡逑圖１－１邋ＥＳＣＲＴ復(fù)合物及的組成和相互作用［２６］逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＥＳＣＲＴ邋ｍａｃｈｉｎｅｒｙ逡逑１．３邋Ｖｐｓ４結(jié)構(gòu)及相互作用蛋白逡逑Ｖｐｓ４邋是邋ＡＡＡ（ＡＴＰａｓｅｓ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｖｅｒｓｅｅｌｌｕｌａｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）邋ＡＴＰ邋酶家族的逡逑成員，具有尚度保守的蛋白質(zhì)序列、Ｓ間結(jié)構(gòu)，在ＭＶＢ途徑、胞質(zhì)分裂、病逡逑毒出芽中都發(fā)揮重要作用。Ｖｐｓ４的空間結(jié)構(gòu)［２７，２８１：邋Ｎ端為ＭＩＴ結(jié)構(gòu)域，其上逡逑下兩面均能與含有ＭＩＭ的蛋白質(zhì)結(jié)合；Ｃ端為保守的�。崧菪ǎ缅澹瑁澹欤椋�；中間逡逑是ＡＡＡ結(jié)構(gòu)域，包括一大一小兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，二者之間能結(jié)合ＡＴＰ；邋Ｖｐｓ４特逡逑有的小Ｐ片層結(jié)構(gòu)是在�。粒粒羴喗Y(jié)構(gòu)中，稱為Ｐ結(jié)構(gòu)域，其側(cè)面能與Ｖｔａｌ邋Ｃ端逡逑的ＶＳＬ（Ｖｔａｌ、ＳＢＰ１、ＬＩＰ５）結(jié)構(gòu)域結(jié)合；Ｖｐｓ４結(jié)合ＡＴＰ后可形成雙層環(huán)狀的逡逑尾對(duì)尾式的１２聚體，每層組成一個(gè)６元環(huán)，兩層之間含有一中間孔道；卩結(jié)構(gòu)逡逑域與Ｖｔａｌ結(jié)合可穩(wěn)定與ＡＴＰ結(jié)合之后形成的１２聚體結(jié)構(gòu)；Ｃ邋ｈｅｌｉｘ向環(huán)內(nèi)伸逡逑展，上、下層相鄰亞基的Ｃ邋ｈｅｌｉｘ形成二聚體來連接并穩(wěn)定雙層環(huán)［２９］。人類逡逑基因編碼兩種同源蛋白ＶＰＳ４Ａ和ＶＰＳ４Ｂ，二者同源性約為８０％，但兩同源基逡逑因分布在不同染色體

圖３－１小鼠Ｆ／ｗ撲ｇＤＮＡ刪除序列及擴(kuò)增測(cè)序圖逡逑（Ａ）啦辦基因敲除策略圖。（Ｂ）小鼠Ｆ／ｗ辦基因刪除序列及擴(kuò)增測(cè)序圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋ｇＤＮＡ邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ邋ｏｆ邋Ｖｐｓ４ｂ邋ｇｅｎｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ邋ｍｉｃｅ逡逑（Ａ）Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｖｐｓ４ｂｇＱｒ＼Ｑ邋ｅｄｉｔｉｎｇ．邋（Ｂ）ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｇＤＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑ａｔｏｇｒａｍｓ邋ｂｙ邋Ｓａｎｇｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｖｐｓ４ｂ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ａ邋ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ邋９９９ｂｐｏｆ邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑ｅ邋ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅｍｉｃｅ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｏｓｅ邋ｏｆ邋ｗｉｄｅ－ｔｙｐｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｏ邋ｇｕａｒａｎｔｅｅ邋ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ邋ｔｈｅ逡逑ｄｅ－ｔｙｐｅａｌｌｅｌｅ邋ｏｆ邋ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ邋ｍｉｃｅ，邋ａ邋ｌｅｎｇｔｈｅｎｅｄ邋４２５ｂｐ邋ｆｒｏｍ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｔｈｅ邋ｕｐｓｔｒｅａｍ邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ逡逑ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｗａｓ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ．逡逑因此我們用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組小鼠均為ＦｐＭ６＋Ａ－ＫＯ小鼠。小鼠出生后２１逡逑其進(jìn)行分籠、剪趾編號(hào)及基因型鑒定，對(duì)小鼠進(jìn)行編號(hào)及基因型記錄。逡逑小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)逡逑基于大量實(shí)驗(yàn)研宄表明內(nèi)體運(yùn)輸相關(guān)基因突變可導(dǎo)致癲癇、ＡＤ、ＰＤ等神經(jīng)逡逑性疾病。前期文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)Ｖｐｓ４ｂ可影響細(xì)胞內(nèi)ＡＰ生成，推測(cè)其在動(dòng)物體逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 夏恒傳;張春霞;馮凡;袁弋;周陽;劉曉勇;朱克明;姚勤;陳克平;;多囊體生物發(fā)生和蛋白質(zhì)分揀——ESCRT、Vps4、Ubiquitination一個(gè)都不能少[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2013年02期

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本文編號(hào)：2796833