【摘要】：水稻中的蛋白質(zhì)是水稻中最為重要的營養(yǎng)品質(zhì)之一,其含量僅次于稻米中的淀粉含量,居于第二位。伴隨著人們生活水平的逐漸提高,食療保健也成為了人們所選擇的一種生活方式,食用蛋白質(zhì)含量過高的稻米會加重糖尿病患者和腎臟病人的負(fù)擔(dān),而健康人群卻可以食用蛋白質(zhì)含量高的稻米以增加蛋白質(zhì)的攝入。因此,研究控制水稻蛋白質(zhì)含量的分子機制,發(fā)掘調(diào)控水稻蛋白質(zhì)含量的相關(guān)分子位點及相關(guān)載體材料,隨后通過育種手段來對水稻中的蛋白質(zhì)含量進行改良,為培育滿足不同人群不同品質(zhì)需求的水稻品種,成為了水稻育種上一個具有深遠(yuǎn)意義的目標(biāo)。前人對于水稻中蛋白質(zhì)的研究主要集中于使用連鎖分析的研究方法進行糙米或精米蛋白質(zhì)的QTL定位,鮮有研究致力于水稻中的各種不同蛋白成分。關(guān)聯(lián)分析是用于解析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的一種主要方法,分為全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide Association Study,GWAS)和候選基因關(guān)聯(lián)分析(Candidate-gene Association Analysis)。因此,本研究采用具有廣泛地理來源的329份水稻試驗材料構(gòu)建而成的自然群體,以及均勻分布于水稻全基因組的154對SSR(Simple Sequence Repeat)引物,采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究方法,對水稻籽粒中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四種蛋白成分進行分析,進一步發(fā)掘與各種蛋白表型顯著相關(guān)的優(yōu)異等位變異及載體材料,對于改良水稻蛋白質(zhì)含量及各成分比例具有重要意義。利用從基礎(chǔ)試驗群體中選擇的128份更具代表性試驗材料構(gòu)建而成的自然群體及測序得到的谷蛋白候選基因GluA和GluB1的基因序列,采用候選基因關(guān)聯(lián)分析的研究方法,發(fā)掘與水稻谷蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)的SNP、InDel位點及相關(guān)優(yōu)勢單倍型,為采用分子育種手段改良水稻谷蛋白含量提供理論參考。主要研究結(jié)果如下:(1)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法對自然群體中包含的329份水稻材料進行兩年四種蛋白成分的檢測,試驗群體中存在明顯的變異且變異范圍較大,各種性狀在試驗群體中均符合正態(tài)分布,表現(xiàn)出了較為典型的數(shù)量性狀遺傳特征。(2)利用154對均勻分布于水稻12條染色體的SSR標(biāo)記,對試驗自然群體分別進行了遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析和連鎖不平衡分析。在329份試驗材料中一共擴增出了845個等位變異,等位變異的平均值為5.49,等位變異的范圍在2到9之間;親緣關(guān)系分析顯示,親緣關(guān)系系數(shù)為0的比例為58.6%,系數(shù)在0到0.1之間的比例為90.6%,說明試驗群體中材料之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);連鎖不平衡分析表明,41.35%的位點組合呈現(xiàn)出了顯著的連鎖不平衡(P0.01),各個亞群中的連鎖不平衡水平高于整個自然群體的連鎖不平衡水平;群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,整個群體可以被分為3個亞群,存在1個MIX亞群,3個亞群中的品種數(shù)量分別為29、81和147。(3)利用154對SSR標(biāo)記通過TASSEL軟件中的一般線性模型(General Linear Model,GLM)和混合線性模型(Mixed Linear Model,MLM)分別對稻米籽粒中的四種蛋白成分進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示在兩年的研究中,一共有15個位點在GLM和MLM兩種模型下均能夠檢測到。與清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白顯著關(guān)聯(lián)的位點數(shù)分別為5個、5個、2個和3個。(4)得到了四種蛋白組分的優(yōu)異等位變異。其中,與清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白相關(guān)的優(yōu)異等位變異分別為RM233、RM253和RM1284,與高谷蛋白含量相關(guān)的優(yōu)異等位變異為RM415,與低谷蛋白含量相關(guān)的優(yōu)異等位變異為RM241。(5)對水稻谷蛋白合成基因GluA和GluB1分別進行了深度測序。在GluA中,基因范圍內(nèi)一共檢測到了128個多態(tài)性位點,排除頻率低于5%的多態(tài)性位點,在編碼區(qū)和非編碼區(qū)一共檢測到46個SNP位點和8個InDel位點;在GluB1中,整個基因范圍內(nèi)一共檢測到了269個多態(tài)性位點,排除頻率低于5%的多態(tài)性位點,在編碼區(qū)和非編碼區(qū)一共檢測到了10個SNP突變及InDel突變,其中6個是SNP突變,4個是InDel突變。(6)利用TASSEL5.0軟件分別對兩個候選基因進行中性選擇分析和連鎖不平衡分析。在基因GluA范圍內(nèi),除了第一個外顯子,第二個外顯子和第一個內(nèi)含子之外,均顯著偏離中性進化模型;在基因GluB1范圍內(nèi),除了第二個內(nèi)含子,基因范圍內(nèi)的其他區(qū)域均顯著地偏離中性進化模型。對于兩個候選基因的連鎖不平衡分析,在基因GluA范圍內(nèi),幾乎所有的多態(tài)性位點均處于連鎖不平衡的狀態(tài)(包含出現(xiàn)頻率高于5%的多態(tài)性位點),且連鎖不平衡情況均為顯著;而在基因GluB1范圍內(nèi),在檢測到的10個SNP及InDel位點中,并不存在顯著的連鎖不平衡情況。(7)利用154對SSR標(biāo)記對128份材料構(gòu)建而成的試驗群體進行群體結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果顯示試驗材料可以被劃分為3個亞群。3個亞群中的材料數(shù)量分別為35、11和57,同時存在一個MIX亞群,各亞群中材料的劃分情況與之前群體的劃分的情況基本一致。(8)對兩個候選基因分別進行了單倍型分析。在基因GluA中,頻率高于5%的多態(tài)性位點將整個群體劃分成了37個單倍型,單倍型多態(tài)性(Haplotype diversity,Hd)為0.461。材料在基因GluA的所有單倍型中展現(xiàn)出了不平衡分布,其中單倍型GluAHap-1(基因GluA的第1個單倍型)包含了73份試驗材料;在基因GluB1中,可以通過檢測到的多態(tài)性位點劃分出21個單倍型,單倍型多態(tài)性為0.341,同樣呈現(xiàn)出不平衡的分布,其中單倍型GluB1Hap-1(基因GluB1的第1個單倍型)包含了84份試驗材料,兩個基因的單倍型多態(tài)性都相對較低。(9)對兩個基因分別進行了蛋白型分析。在基因GluA中,大部分SNP位點位于該基因的第1個外顯子區(qū)域內(nèi),最終43個SNP位點將整個群體分成了27個蛋白單倍型;在基因GluB1中,只有1個SNP位點位于外顯子區(qū)域內(nèi),所以蛋白單倍型被劃分為兩種。兩個基因中的蛋白單倍型均呈現(xiàn)出不平衡的分布,其中CDS_GluAHap-1(基因GluA的第1個蛋白單倍型)包含了89份試驗材料,CDS_GluB1Hap-1(基因GluB1的第1個蛋白單倍型)包含了121份試驗材料。(10)利用TASSEL5.0軟件中的GLM模型和MLM模型進行候選基因關(guān)聯(lián)分析。在GluA中,兩種模型下檢測到了5個與水稻籽粒谷蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點,均為SNP,分別位于GluA序列的10 bp、22 bp、55 bp、78 bp和87 bp處;在GluB1中,兩種模型下檢測到了2個與水稻籽粒谷蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點,其中1個為SNP,另1個為InDel,分別位于GluB1序列的1426 bp處和1489 bp處。在GluA中,發(fā)現(xiàn)了兩種低谷蛋白含量的單倍型,分別是GluAHap-10和GluAHap-34;在GluB1中,同樣發(fā)現(xiàn)了兩種低谷蛋白含量的單倍型,分別是GluB1Hap-5和GluB1Hap-12。(11)利用高分辨率溶解曲線技術(shù)(High-resolution melting curve,HRM)對檢測到的SNP和InDel位點進行驗證,結(jié)果表明溶解曲線的圖像與檢測到的序列多態(tài)性位點保持一致,驗證了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

圖 3-1 Structure2.3.4 分析預(yù)測的△K 值Fig. 3-1 The estimated value of △K via the software structure 2.3.4

圖 3-3 Structure2.3.4 分析的△K 值隨 K 值的變化曲線The changing curve of △K following the K value changes using the software Str

水稻谷蛋白合成基因 GluA 中多態(tài)性位點的連鎖不平衡情況（基因 GluA 中的多態(tài)性、3、5、7、9、10、11、15、16、18、19、20、21、22、24、25、27、28、29、36、39、41、43、46、48、49、51、52、54、55、59、60、61、64、70、74、78、85、87、88、90、91、92、599、601、860、894、1344、1347、1377、1425） 3-5 The linkage disequilibrium of the polymorphic sites of the GluA gene (The positionsorphic sites of the GluA gene: 1、3、5、7、9、10、11、15、16、18、19、20、21、7、28、29、31、33、34、36、39、41、43、46、48、49、51、52、54、55、59、、74、78、79、82、85、87、88、90、91、92、599、601、860、894、1344、1347、1425)

【參考文獻】

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本文編號：2796758