發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 18:03

【摘要】：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery heart disease,CHD)發(fā)病原因?yàn)楫惓５闹|(zhì)代謝,在冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜形成粥樣斑塊,導(dǎo)致血管腔狹窄或堵塞。冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)是目前臨床上治療CHD的主要外科治療手段。CHD常有多種并發(fā)疾病,其中包括高血壓、心功能不全、糖尿病、以及慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)等。與CHD合并糖尿病或高血壓、心功能不全等疾病相比,COPD患者圍術(shù)期更易發(fā)生意外事件,增加患者術(shù)后意外事件發(fā)生率及死亡率。目前醫(yī)學(xué)界對于CHD合并COPD患者的重視程度越來越高。CHD與COPD具有一些共同的危險(xiǎn)因素。在臨床上的實(shí)際治療過程中,除了依靠患者病史、體征及相關(guān)檢查及傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素對疾病進(jìn)行預(yù)測、預(yù)防和治療之外,對一些可能會(huì)影響CHD合并COPD患者病情轉(zhuǎn)歸、預(yù)測急性加重發(fā)作頻率或者預(yù)后情況的相關(guān)分子標(biāo)志物進(jìn)行深入探索和研究,對于在疾病發(fā)生早期進(jìn)行識(shí)別并監(jiān)測,選擇適合的干預(yù)手段具有十分重要的意義。同時(shí),對CHD合并COPD患者加以重視,最終能夠起到改善此類患者預(yù)后,延長其生存期的目的。血清對氧磷酯酶1(serum paraoxonase1,PON1)由人體肝臟合成,由于其抗氧化特性成為目前研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),PON1對低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)具有保護(hù)作用,因此其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能。PON1具有抗炎作用�；蛐脱芯恳约懊阜z測PON1表型研究的結(jié)果表明,不同個(gè)體之間PON1活性可相差10~40倍。PONI活性的改變與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展之間存在密切聯(lián)系。糖尿病、家族性高膽固醇血癥、心肌梗死等疾病患者血清中PON1活性均發(fā)生不同程度的下降。近年來對PON1活性的研究均顯示,單純依靠基因多態(tài)性不足以作為完全的冠心病的危險(xiǎn)因素,其原因是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者當(dāng)中,PON1的活性更為重要,PON1的活性下降引起HDL抗氧化作用發(fā)生明顯下調(diào)�；蚨鄳B(tài)性是指在一個(gè)生物群體中,同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型基因或等位基因。有調(diào)節(jié)作用的功能區(qū)突變,及鄰近位點(diǎn)的突變能夠通過影響蛋白質(zhì)基因表達(dá)量,及活性變化,進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能。單核苷酸多態(tài)性(SNP),即散在的單個(gè)堿基的不同,基因組中單核苷酸的缺失,插入與重復(fù)序列不屬於SNP,但更多的是單個(gè)堿基的置換。SNP通常是一種雙等位基因的或二態(tài)的變異。目前大量研究結(jié)果顯示,PON1基因多態(tài)性與多種心腦血管事件的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),其中包括冠心病、缺血性腦卒中、腦梗死等,因此有希望作為預(yù)測上述疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。近幾年來已有大量關(guān)于PON1與冠心病關(guān)系的研究,但目前尚未有關(guān)于PON1基因多態(tài)性與冠心病合并COPD患者行CABG術(shù)后臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究。為此,本研究首次對上述問題進(jìn)行了探討。自從研究者們發(fā)現(xiàn)miRNA以來,越來越多的證據(jù)表明,miRNA與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展之間存在密切聯(lián)系。在疾病發(fā)生部位的組織細(xì)胞中,其miRNA表達(dá)譜通常相較于機(jī)體正常組織細(xì)胞存在顯著差異。心血管系統(tǒng)有著特別豐富的miRNA,miRNA在心血管疾病中充當(dāng)多種多樣的角色。miRNA在心血管系統(tǒng)的高表達(dá)及心肌損傷時(shí)的異常表達(dá)給心肌缺血疾病的治療帶來了新的方向,研究者期望通過調(diào)控miRNA的表達(dá)而減輕心肌缺血缺氧損傷。miRNA在心血管疾病中作用及其相關(guān)機(jī)制的研究尚處于起步階段。本研究分別對CHD合并COPD患者的PON1基因序列的rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)等位基因三種基因表型(CC:212;TC:75;TT:5)與行CABG術(shù)后的臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行探討,同時(shí)采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法研究miR-616與PON1的相關(guān)性,旨在為CHD合并COPD患者行CABG術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的早期預(yù)防和診斷,早期干預(yù)治療提供理論依據(jù)。目的為了研究CHD合并COPD患者PON1基因多態(tài)性與行CABG術(shù)預(yù)后的相關(guān)性及其作用機(jī)制,本研究分別對三種PON1基因型(CC:212、TC:75和TT:5)的冠心病合并COPD患者外周血中PON1的基因型與行CABG后的臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行探討;采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法研究miR-616與PON1的相關(guān)性,探討CHD合并COPD患者體內(nèi)PON1表達(dá)及活性變化的機(jī)制,旨在為冠心病合并COPD患者行CABG術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的早期預(yù)防和診斷及治療提供理論依據(jù)。方法(1)選取2010~2017年于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院行CABG術(shù)的CHD合并COPD的患者共292例。所有入選患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影診斷為冠心病,采集上述患者的外周血樣品。提取各血液樣品DNA,隨后采用酶切法測序確定各樣本PON1基因rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)的基因型,依照其基因型的不同將所有入選患者劃分為3組,分別為CC:212組、TC:75組和TT:5組,隨后分析了上述三種基因型與患者年齡、性別、總體水平、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等因素之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier和Cox回歸分析研究了PON1 rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)基因型是否與CABG術(shù)后CHD合并COPD患者無事件存活期有關(guān)。(2)分離培養(yǎng)原代人肝細(xì)胞,并對其PON1基因型進(jìn)行鑒定(把PON1 rs3735590 SNP位點(diǎn)TT、TC型合并為一組PON1T,這一組PON1 rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)基因型等位基因攜帶T堿基)。應(yīng)用生物學(xué)軟件,預(yù)測miR-616的靶基因。利用PCR方法,根據(jù)PON1基因序列信息設(shè)計(jì)其3'UTR擴(kuò)增引物,用PCR方法將PON1基因的3'UTR序列擴(kuò)增,把擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到含有熒光素酶報(bào)告基因的載體之中,突變PON1基因3'UTR序列中的靶點(diǎn)序列,構(gòu)建含PON1基因3'UTR突變序列的熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒(PON13’UTR Mut),對比需要,我們構(gòu)建野生型含有PON1基因的3'UTR序列熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒(PON13’UTR WT)。將不同濃度的miR-616 mimic(25nM,50nM,75nM)分別與含有熒光素酶報(bào)告基因的PON13’UTR-WT和PON13’UTR-Mut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PON1 CC型人肝細(xì)胞。檢測細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平。分別將miR-NC和不同濃度miR-616 mimic/inhibitor(25 nM、50 nM、75 nM)轉(zhuǎn)染PON1 CC、T型肝細(xì)胞,48 h后采用熒光定量PCR和western blot法分別檢測細(xì)胞中miR-616、PON1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,采用ELISA法檢測PON1活性。結(jié)果(1)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,3組PON1基因型患者在年齡、性別、總體水平和LDL之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但CC:212組患者的HDL與TC:75組和TT:5組患者相比明顯降低(P0.05)。結(jié)果表明,與TC和TT基因型相比,CC基因型患者的無事件存活期明顯降低(P0.05),表明CABG術(shù)后冠心病患者生存期與PON1 rs3735590的多態(tài)性位點(diǎn)T等位基因有關(guān)。(2)PON1被預(yù)測為miR-616的靶基因,miR-616在PON1上結(jié)合的位置位于其3’UTR區(qū)域。隨著miR-616 mimic轉(zhuǎn)染濃度的增高,PON1 WT組細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)量逐漸降低,呈劑量依賴性;而PON1 Mut組細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平則無明顯變化。隨著miR-616 mimic轉(zhuǎn)染濃度的增高,PON1 CC型肝細(xì)胞中miR-616的表達(dá)水平逐漸增高,呈劑量依賴性;PON1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平逐漸降低,呈劑量依賴性;PON1活性逐漸降低,呈劑量依賴性。隨著miR-616 inhibitor轉(zhuǎn)染濃度的增高,PON1CC型肝細(xì)胞中肝細(xì)胞中miR-616的表達(dá)水平逐漸降低,呈劑量依賴性;PON1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平逐漸增高,呈劑量依賴性;PON1活性逐漸增高,呈劑量依賴性。隨著miR-616 mimic轉(zhuǎn)染濃度的增高,PON1 TC、TT型肝細(xì)胞中miR-616的表達(dá)水平逐漸增高,呈劑量依賴性;隨著miR-616inhibitor轉(zhuǎn)染濃度的增高,PON1 TC、TT型肝細(xì)胞中miR-616的表達(dá)水平逐漸降低,呈劑量依賴性;無論miR-616增高或降低,PON1 TC、TT型肝細(xì)胞中PON1mRNA和蛋白的表達(dá)、PON1活性均無明顯變化(P0.05)。結(jié)論冠心病合并慢性阻塞性肺疾病的患者群體,其PON1基因序列中,rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)為PON1 CC型患者術(shù)后無事件存活期更短,預(yù)后與CT、TT型患者相比更差;miR-616對PON1 CC型肝細(xì)胞中PON1的表達(dá)及其活性存在抑制作用,而對PON1 TT、TC型細(xì)胞無相應(yīng)作用,推測這可能是攜帶PON1 CC基因型的CHD合并COPD患者的PON1活性更低,導(dǎo)致行CABG術(shù)后炎癥反應(yīng)程度較攜帶TC和TT基因型的患者更高,而術(shù)后無事件存活期則更短的原因。PON1 rs3735590多態(tài)性位點(diǎn)的基因型PON1CC可作為CHD合并COPD患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563.9
【圖文】：

因?yàn)樽宰兞窟M(jìn)行多因素 Logistic 回歸分析 PON1 基因究結(jié)果顯示，攜帶 CC 基因型是 CABG 術(shù)后 MACE 的獨(dú)立為 3.647（1.633~6.275），P=0.016，見表 1-4。PON1 基因多態(tài)性與術(shù)后 MACE 的多因素 Logistic 回歸分析Β SE Wald P 值 RR（95%1.767 0.243 9.160 0.017 3.639（1.622.110 1.291 3.617 0.087 6.919（0.942.229 1.393 4.001 0.100 5.273（0.79因型患者 CABG 術(shù)后無事件生存期比較用 Kaplan-Meier 和 Cox 回歸分析研究了 PON1 rs373患者無事件存活期有關(guān)。如圖 1-1 所示，與 TC 和 TT 基的無事件存活率明顯降低（P<0.05），表明 CABG 術(shù)后1 rs3735590 的多態(tài)性 T 等位基因有關(guān)。

圖 1-1 樣品倍比稀釋示意圖物素化抗體工作液制備：在實(shí)驗(yàn)開始前對當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需的生物量進(jìn)行計(jì)算（100 μ/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)當(dāng)多配制 100~200μ前 15 min 時(shí)采用生物素化抗體稀釋液將生物素化抗體原液按釋成工作濃度，該試劑要求現(xiàn)配現(xiàn)用。結(jié)合物工作液的制備：在實(shí)驗(yàn)開始前對當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需的酶結(jié)合計(jì)算（100 μ/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)當(dāng)多配制 100~200μL，在使用采用酶結(jié)合物稀釋液將酶結(jié)合物原液按照 1：100 稀釋成工作劑要求現(xiàn)配現(xiàn)用。酶標(biāo)板上分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，用微量移液器 50 μL 并將之加入至酶標(biāo)板上的標(biāo)準(zhǔn)孔中，樣品稀釋倍數(shù)為加樣操作時(shí)應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確將試劑和樣品加入酶標(biāo)板上相應(yīng)反應(yīng)孔的與孔壁接觸，待加樣完畢后輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板使孔內(nèi)溶液徹底混

用空白管調(diào)零，檢測各孔在 412 nm 波長下的吸光度值（OD 值），品的濃度作為橫坐標(biāo)，OD 值作為縱坐標(biāo)，于坐標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)檢測獲得的待測樣品的 OD 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找出對應(yīng)的 PON1 活將獲得的活性值乘以稀釋倍數(shù)即得到樣品中 PON1 的活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)研究中均用 EXCEL 表格錄入所有數(shù)據(jù)，采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均按照 x±s來表示，兩樣本間均數(shù)比較采用t數(shù)比較采用單因素方差分析，當(dāng) P<0.05 時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。果測 miR-616 作用靶點(diǎn)的結(jié)果們首先通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測了 miR-616 靶點(diǎn)， PON1 基因的 3預(yù)測為 miR-616 的一個(gè)靶基因（圖 2-1）。

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本文編號(hào)：2796550