發(fā)布時間：2020-08-18 18:03

【摘要】：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery heart disease,CHD)發(fā)病原因為異常的脂質代謝,在冠狀動脈內膜形成粥樣斑塊,導致血管腔狹窄或堵塞。冠狀動脈旁路移植術(CABG)是目前臨床上治療CHD的主要外科治療手段。CHD常有多種并發(fā)疾病,其中包括高血壓、心功能不全、糖尿病、以及慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)等。與CHD合并糖尿病或高血壓、心功能不全等疾病相比,COPD患者圍術期更易發(fā)生意外事件,增加患者術后意外事件發(fā)生率及死亡率。目前醫(yī)學界對于CHD合并COPD患者的重視程度越來越高。CHD與COPD具有一些共同的危險因素。在臨床上的實際治療過程中,除了依靠患者病史、體征及相關檢查及傳統(tǒng)危險因素對疾病進行預測、預防和治療之外,對一些可能會影響CHD合并COPD患者病情轉歸、預測急性加重發(fā)作頻率或者預后情況的相關分子標志物進行深入探索和研究,對于在疾病發(fā)生早期進行識別并監(jiān)測,選擇適合的干預手段具有十分重要的意義。同時,對CHD合并COPD患者加以重視,最終能夠起到改善此類患者預后,延長其生存期的目的。血清對氧磷酯酶1(serum paraoxonase1,PON1)由人體肝臟合成,由于其抗氧化特性成為目前研究熱點。研究發(fā)現(xiàn),PON1對低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)具有保護作用,因此其具有抗動脈粥樣硬化的功能。PON1具有抗炎作用�；蛐脱芯恳约懊阜z測PON1表型研究的結果表明,不同個體之間PON1活性可相差10~40倍。PONI活性的改變與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展之間存在密切聯(lián)系。糖尿病、家族性高膽固醇血癥、心肌梗死等疾病患者血清中PON1活性均發(fā)生不同程度的下降。近年來對PON1活性的研究均顯示,單純依靠基因多態(tài)性不足以作為完全的冠心病的危險因素,其原因是在冠狀動脈粥樣硬化患者當中,PON1的活性更為重要,PON1的活性下降引起HDL抗氧化作用發(fā)生明顯下調�；蚨鄳B(tài)性是指在一個生物群體中,同時和經常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型基因或等位基因。有調節(jié)作用的功能區(qū)突變,及鄰近位點的突變能夠通過影響蛋白質基因表達量,及活性變化,進而影響蛋白質功能。單核苷酸多態(tài)性(SNP),即散在的單個堿基的不同,基因組中單核苷酸的缺失,插入與重復序列不屬於SNP,但更多的是單個堿基的置換。SNP通常是一種雙等位基因的或二態(tài)的變異。目前大量研究結果顯示,PON1基因多態(tài)性與多種心腦血管事件的發(fā)生和發(fā)展有關,其中包括冠心病、缺血性腦卒中、腦梗死等,因此有希望作為預測上述疾病發(fā)生的危險因素。近幾年來已有大量關于PON1與冠心病關系的研究,但目前尚未有關于PON1基因多態(tài)性與冠心病合并COPD患者行CABG術后臨床病理參數(shù)關系的研究。為此,本研究首次對上述問題進行了探討。自從研究者們發(fā)現(xiàn)miRNA以來,越來越多的證據(jù)表明,miRNA與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展之間存在密切聯(lián)系。在疾病發(fā)生部位的組織細胞中,其miRNA表達譜通常相較于機體正常組織細胞存在顯著差異。心血管系統(tǒng)有著特別豐富的miRNA,miRNA在心血管疾病中充當多種多樣的角色。miRNA在心血管系統(tǒng)的高表達及心肌損傷時的異常表達給心肌缺血疾病的治療帶來了新的方向,研究者期望通過調控miRNA的表達而減輕心肌缺血缺氧損傷。miRNA在心血管疾病中作用及其相關機制的研究尚處于起步階段。本研究分別對CHD合并COPD患者的PON1基因序列的rs3735590多態(tài)性位點等位基因三種基因表型(CC:212;TC:75;TT:5)與行CABG術后的臨床病理學參數(shù)之間的關系進行探討,同時采用體外細胞實驗的方法研究miR-616與PON1的相關性,旨在為CHD合并COPD患者行CABG術后相關并發(fā)癥的早期預防和診斷,早期干預治療提供理論依據(jù)。目的為了研究CHD合并COPD患者PON1基因多態(tài)性與行CABG術預后的相關性及其作用機制,本研究分別對三種PON1基因型(CC:212、TC:75和TT:5)的冠心病合并COPD患者外周血中PON1的基因型與行CABG后的臨床病理學參數(shù)之間的關系進行探討;采用體外細胞實驗的方法研究miR-616與PON1的相關性,探討CHD合并COPD患者體內PON1表達及活性變化的機制,旨在為冠心病合并COPD患者行CABG術后相關并發(fā)癥的早期預防和診斷及治療提供理論依據(jù)。方法(1)選取2010~2017年于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院行CABG術的CHD合并COPD的患者共292例。所有入選患者均經冠狀動脈造影診斷為冠心病,采集上述患者的外周血樣品。提取各血液樣品DNA,隨后采用酶切法測序確定各樣本PON1基因rs3735590多態(tài)性位點的基因型,依照其基因型的不同將所有入選患者劃分為3組,分別為CC:212組、TC:75組和TT:5組,隨后分析了上述三種基因型與患者年齡、性別、總體水平、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等因素之間的關系。采用Kaplan-Meier和Cox回歸分析研究了PON1 rs3735590多態(tài)性位點基因型是否與CABG術后CHD合并COPD患者無事件存活期有關。(2)分離培養(yǎng)原代人肝細胞,并對其PON1基因型進行鑒定(把PON1 rs3735590 SNP位點TT、TC型合并為一組PON1T,這一組PON1 rs3735590多態(tài)性位點基因型等位基因攜帶T堿基)。應用生物學軟件,預測miR-616的靶基因。利用PCR方法,根據(jù)PON1基因序列信息設計其3'UTR擴增引物,用PCR方法將PON1基因的3'UTR序列擴增,把擴增產物克隆到含有熒光素酶報告基因的載體之中,突變PON1基因3'UTR序列中的靶點序列,構建含PON1基因3'UTR突變序列的熒光素酶報告基因的質粒(PON13’UTR Mut),對比需要,我們構建野生型含有PON1基因的3'UTR序列熒光素酶報告基因的質粒(PON13’UTR WT)。將不同濃度的miR-616 mimic(25nM,50nM,75nM)分別與含有熒光素酶報告基因的PON13’UTR-WT和PON13’UTR-Mut質粒轉染PON1 CC型人肝細胞。檢測細胞中熒光素酶的表達水平。分別將miR-NC和不同濃度miR-616 mimic/inhibitor(25 nM、50 nM、75 nM)轉染PON1 CC、T型肝細胞,48 h后采用熒光定量PCR和western blot法分別檢測細胞中miR-616、PON1 mRNA和蛋白的表達水平,采用ELISA法檢測PON1活性。結果(1)t檢驗結果顯示,3組PON1基因型患者在年齡、性別、總體水平和LDL之間均無統(tǒng)計學差異(P0.05),但CC:212組患者的HDL與TC:75組和TT:5組患者相比明顯降低(P0.05)。結果表明,與TC和TT基因型相比,CC基因型患者的無事件存活期明顯降低(P0.05),表明CABG術后冠心病患者生存期與PON1 rs3735590的多態(tài)性位點T等位基因有關。(2)PON1被預測為miR-616的靶基因,miR-616在PON1上結合的位置位于其3’UTR區(qū)域。隨著miR-616 mimic轉染濃度的增高,PON1 WT組細胞中熒光素酶的表達量逐漸降低,呈劑量依賴性;而PON1 Mut組細胞中熒光素酶的表達水平則無明顯變化。隨著miR-616 mimic轉染濃度的增高,PON1 CC型肝細胞中miR-616的表達水平逐漸增高,呈劑量依賴性;PON1 mRNA和蛋白的表達水平逐漸降低,呈劑量依賴性;PON1活性逐漸降低,呈劑量依賴性。隨著miR-616 inhibitor轉染濃度的增高,PON1CC型肝細胞中肝細胞中miR-616的表達水平逐漸降低,呈劑量依賴性;PON1 mRNA和蛋白的表達水平逐漸增高,呈劑量依賴性;PON1活性逐漸增高,呈劑量依賴性。隨著miR-616 mimic轉染濃度的增高,PON1 TC、TT型肝細胞中miR-616的表達水平逐漸增高,呈劑量依賴性;隨著miR-616inhibitor轉染濃度的增高,PON1 TC、TT型肝細胞中miR-616的表達水平逐漸降低,呈劑量依賴性;無論miR-616增高或降低,PON1 TC、TT型肝細胞中PON1mRNA和蛋白的表達、PON1活性均無明顯變化(P0.05)。結論冠心病合并慢性阻塞性肺疾病的患者群體,其PON1基因序列中,rs3735590多態(tài)性位點為PON1 CC型患者術后無事件存活期更短,預后與CT、TT型患者相比更差;miR-616對PON1 CC型肝細胞中PON1的表達及其活性存在抑制作用,而對PON1 TT、TC型細胞無相應作用,推測這可能是攜帶PON1 CC基因型的CHD合并COPD患者的PON1活性更低,導致行CABG術后炎癥反應程度較攜帶TC和TT基因型的患者更高,而術后無事件存活期則更短的原因。PON1 rs3735590多態(tài)性位點的基因型PON1CC可作為CHD合并COPD患者預后的獨立危險因素。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R563.9
【圖文】：

因為自變量進行多因素 Logistic 回歸分析 PON1 基因究結果顯示，攜帶 CC 基因型是 CABG 術后 MACE 的獨立為 3.647（1.633~6.275），P=0.016，見表 1-4。PON1 基因多態(tài)性與術后 MACE 的多因素 Logistic 回歸分析Β SE Wald P 值 RR（95%1.767 0.243 9.160 0.017 3.639（1.622.110 1.291 3.617 0.087 6.919（0.942.229 1.393 4.001 0.100 5.273（0.79因型患者 CABG 術后無事件生存期比較用 Kaplan-Meier 和 Cox 回歸分析研究了 PON1 rs373患者無事件存活期有關。如圖 1-1 所示，與 TC 和 TT 基的無事件存活率明顯降低（P<0.05），表明 CABG 術后1 rs3735590 的多態(tài)性 T 等位基因有關。

圖 1-1 樣品倍比稀釋示意圖物素化抗體工作液制備：在實驗開始前對當次實驗所需的生物量進行計算（100 μ/孔），實際配制時應當多配制 100~200μ前 15 min 時采用生物素化抗體稀釋液將生物素化抗體原液按釋成工作濃度，該試劑要求現(xiàn)配現(xiàn)用。結合物工作液的制備：在實驗開始前對當次實驗所需的酶結合計算（100 μ/孔），實際配制時應當多配制 100~200μL，在使用采用酶結合物稀釋液將酶結合物原液按照 1：100 稀釋成工作劑要求現(xiàn)配現(xiàn)用。酶標板上分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，用微量移液器 50 μL 并將之加入至酶標板上的標準孔中，樣品稀釋倍數(shù)為加樣操作時應當準確將試劑和樣品加入酶標板上相應反應孔的與孔壁接觸，待加樣完畢后輕輕晃動酶標板使孔內溶液徹底混

用空白管調零，檢測各孔在 412 nm 波長下的吸光度值（OD 值），品的濃度作為橫坐標，OD 值作為縱坐標，于坐標紙上繪制出標準依據(jù)檢測獲得的待測樣品的 OD 在標準曲線上查找出對應的 PON1 活將獲得的活性值乘以稀釋倍數(shù)即得到樣品中 PON1 的活性。統(tǒng)計學分析實驗研究中均用 EXCEL 表格錄入所有數(shù)據(jù)，采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計學數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)結果均按照 x±s來表示，兩樣本間均數(shù)比較采用t數(shù)比較采用單因素方差分析，當 P<0.05 時表示有統(tǒng)計學意義。果測 miR-616 作用靶點的結果們首先通過生物信息學軟件預測了 miR-616 靶點， PON1 基因的 3預測為 miR-616 的一個靶基因（圖 2-1）。

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本文編號：2796550