【摘要】：目的:用PCR方法檢測霍亂弧菌ctxAB和zot毒力基因,研究兩毒力基因之間的共存關系,從霍亂弧菌(Vibriocholera)M045中克隆小帶聯結毒素(zonulaoccludenstoxin,zot)的全基因序列,構建其原核表達質粒pET-32a(+)-zot并轉化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中,通過誘導表達和親和層析純化重組蛋白,初步研究zot表達蛋白對人小腸上皮細胞的凋亡作用。方法:1、用PCR檢測方法檢測江西省2000~2012年分離的239株霍亂弧菌中ctxAB和zot毒力基因。2、采用PCR技術從霍亂弧菌M045中抽提基因組DNA中擴增出zot基因。3、將zot基因克隆至原核表達質粒pET-32a(+)中,構建原核表達質粒pET-32a(+)-zot,雙酶切鑒定并DNA測序驗證。4、將重組質粒pET-32a(+)-zot轉化至大腸桿菌BL21(DE3)篩選表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,并用IPTG誘導其表達zot蛋白,利用SDSPAGE分析蛋白產物。5、利用親和層析柱(Ni-IDAResin)純化表達蛋白,用Westernblot對純化蛋白進行鑒定。6、將純化的zot表達蛋白作用于已貼壁生長的人小腸上皮細胞后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果:1、41株ctxAB毒力基因檢測陽性的霍亂弧菌檢測zot基因為陰性,說明ctxAB和zot毒力基因之間不存在共存關系。2、克隆出了全長約1200bp的霍亂弧菌zot基因編碼區(qū),說明PCR擴增zot全基因成功。3、重組質粒雙酶切及DNA測序結果顯示pET-32a(+)-zot構建成功。4、SDS-PAGE分析表達菌株總蛋白顯示在與目標蛋白大小一致的位置出現一條亮的條帶,說明zot蛋白表達成功。5、利用親和層析柱(Ni-IDAResin)獲得純化的重組蛋白,經SDS-PAGE和凝膠成像系統(tǒng)分析,純化蛋白的分子量約為47kD,濃度為0.324mg/ml,經Westernblot驗證重組蛋白為目的蛋白。6、用流式細胞儀檢測經重組蛋白作用的人小腸上皮細胞顯示zot表達蛋白能引起人小腸上皮細胞的早期凋亡。結論:本論文成功地克隆了zot的全基因,成功構建重組質粒pET-32a(+)-zot,成功構建了重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,獲得zot表達的純化蛋白,zot表達蛋白能引起人小腸上皮細胞的早期凋亡。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【圖文】：

第 1 章 引言析，對霍亂弧菌主要毒力基因和管家基因，如 ctxB 和 tcpA 基因測序，并進行生物信息學分析，均獲得了有意義的分析結果。1.3 zot 基因zot 基因編碼的小帶連結毒素(zonula occludens toxin，zot)是 1991 年 Fasano等發(fā)現的毒素，此毒素通過影響細胞間的緊密連接結構或鍵橋，增加小腸粘膜的通透性，對霍亂弧菌引起的腹瀉起輔助作用。zot 基因包含一個 1.3kb 的ORF，位于 ctxA 基因的上游且與 ctxA 基因緊密相臨�；驕y序表明 CTXΦ 編碼的基因排列順序為 cep、orfU、ace、zot、 zot、ctxA 和 ctxB，因此 zot 基因緊鄰于 ctxA 基因的上游（圖 1）。ctxA 基因的起始密碼子和 zot 基因的終止密碼子由 127 個堿基連接，并且 ctxA 基因的起始密碼子和 zot 基因的終止密碼子重復系列重疊[31]。

zot基因擴增圖

3.2.2 重組質粒的酶切分析重組質粒經BamHI和XhoI雙酶切后，產生兩條帶：一條為4.5 kb的pET-32(a+)質粒帶，另外一條約為1 200bp的zot帶（圖3.2）。初步說明zot基因已插入質粒pET-32(a+)載體。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李培;陳徹;席亞明;張豪;李明;鄧偉;;艱難梭菌毒素A誘導K562細胞凋亡及其機制研究[J];中國實驗血液學雜志;2011年03期

2 李慧;王佳賀;何平;彭揚;白雪;吳寶剛;;大腸埃希菌感染對U937細胞凋亡的影響及機制探討[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報;2011年03期

3 劉小紅;沈陽;;艱難梭菌毒素A對膽管癌細胞株FRH-0201增殖和凋亡的影響[J];現代生物醫(yī)學進展;2011年01期

4 劉婷婷;馬麗娜;李鳳云;劉勇;樊蓉;;傷寒沙門菌誘導巨噬細胞凋亡機制的探討[J];中國人獸共患病學報;2010年03期

5 芮勇宇;闞飆;劉朋;高守一;劉延清;祁國明;;我國霍亂弧菌毒力協同調節(jié)菌毛基因序列分析[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2006年04期

6 芮勇宇;許銳恒;闞飆;高守一;俞守義;;霍亂弧菌主要毒力和管家基因序列分析[J];中國公共衛(wèi)生;2006年01期

7 孫陽,李鳳云,王朝夫,唐素蘭,林萍;痢疾志賀菌D_(15)及其L型內毒素致細胞凋亡的研究[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2002年04期

8 仇文穎,王興翠,尚宏偉,李寶紅,孫海梅,郭崇潔,魏育林;內毒素所致SIRS/MODS小鼠脾細胞損傷的形態(tài)學觀察[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2002年02期

9 闞飆,祁國明,劉延清,劉彩蓮,高守一;霍亂弧菌中存在不含霍亂毒素基因的噬菌體CTXΦ基因組[J];中華微生物學和免疫學雜志;1999年03期

10 段廣才，高守一，劉延清，劉捷，祁國明;霍亂弧菌PCR快速檢測及應用研究[J];中華微生物學和免疫學雜志;1994年06期

本文編號：2796319