【摘要】：目的:用PCR方法檢測(cè)霍亂弧菌ctxAB和zot毒力基因,研究兩毒力基因之間的共存關(guān)系,從霍亂弧菌(Vibriocholera)M045中克隆小帶聯(lián)結(jié)毒素(zonulaoccludenstoxin,zot)的全基因序列,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-zot并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中,通過誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化重組蛋白,初步研究zot表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用。方法:1、用PCR檢測(cè)方法檢測(cè)江西省2000~2012年分離的239株霍亂弧菌中ctxAB和zot毒力基因。2、采用PCR技術(shù)從霍亂弧菌M045中抽提基因組DNA中擴(kuò)增出zot基因。3、將zot基因克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-zot,雙酶切鑒定并DNA測(cè)序驗(yàn)證。4、將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-zot轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)篩選表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,并用IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)zot蛋白,利用SDSPAGE分析蛋白產(chǎn)物。5、利用親和層析柱(Ni-IDAResin)純化表達(dá)蛋白,用Westernblot對(duì)純化蛋白進(jìn)行鑒定。6、將純化的zot表達(dá)蛋白作用于已貼壁生長的人小腸上皮細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:1、41株ctxAB毒力基因檢測(cè)陽性的霍亂弧菌檢測(cè)zot基因?yàn)殛幮?說明ctxAB和zot毒力基因之間不存在共存關(guān)系。2、克隆出了全長約1200bp的霍亂弧菌zot基因編碼區(qū),說明PCR擴(kuò)增zot全基因成功。3、重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果顯示pET-32a(+)-zot構(gòu)建成功。4、SDS-PAGE分析表達(dá)菌株總蛋白顯示在與目標(biāo)蛋白大小一致的位置出現(xiàn)一條亮的條帶,說明zot蛋白表達(dá)成功。5、利用親和層析柱(Ni-IDAResin)獲得純化的重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE和凝膠成像系統(tǒng)分析,純化蛋白的分子量約為47kD,濃度為0.324mg/ml,經(jīng)Westernblot驗(yàn)證重組蛋白為目的蛋白。6、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)重組蛋白作用的人小腸上皮細(xì)胞顯示zot表達(dá)蛋白能引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡。結(jié)論:本論文成功地克隆了zot的全基因,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-zot,成功構(gòu)建了重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,獲得zot表達(dá)的純化蛋白,zot表達(dá)蛋白能引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

第 1 章 引言析，對(duì)霍亂弧菌主要毒力基因和管家基因，如 ctxB 和 tcpA 基因測(cè)序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，均獲得了有意義的分析結(jié)果。1.3 zot 基因zot 基因編碼的小帶連結(jié)毒素(zonula occludens toxin，zot)是 1991 年 Fasano等發(fā)現(xiàn)的毒素，此毒素通過影響細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)或鍵橋，增加小腸粘膜的通透性，對(duì)霍亂弧菌引起的腹瀉起輔助作用。zot 基因包含一個(gè) 1.3kb 的ORF，位于 ctxA 基因的上游且與 ctxA 基因緊密相臨。基因測(cè)序表明 CTXΦ 編碼的基因排列順序?yàn)?cep、orfU、ace、zot、 zot、ctxA 和 ctxB，因此 zot 基因緊鄰于 ctxA 基因的上游（圖 1）。ctxA 基因的起始密碼子和 zot 基因的終止密碼子由 127 個(gè)堿基連接，并且 ctxA 基因的起始密碼子和 zot 基因的終止密碼子重復(fù)系列重疊[31]。

zot基因擴(kuò)增圖

3.2.2 重組質(zhì)粒的酶切分析重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，產(chǎn)生兩條帶：一條為4.5 kb的pET-32(a+)質(zhì)粒帶，另外一條約為1 200bp的zot帶（圖3.2）。初步說明zot基因已插入質(zhì)粒pET-32(a+)載體。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2796319