【摘要】：木霉菌(Trichoderma)作為生物活體制劑農(nóng)藥和肥料的有效成分,在植物病害生物防治、土壤環(huán)境改良方面有巨大的應(yīng)用潛力。近年來由于銅及含銅化合物被廣泛應(yīng)用于殺菌劑、化學(xué)殺蟲劑及畜牧食品添加劑等,致使土壤銅含量不斷增加,對土壤微生物造成不良影響,引起土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡和土壤質(zhì)量下降。研究木霉菌銅耐受及代謝相關(guān)機(jī)制,對提高防病效果、改善土壤生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),生防菌哈茨木霉(T.harzianum)Th33中存在一種C2H2型轉(zhuǎn)錄因子,命名為thmea1,該基因在銅脅迫下發(fā)生差異表達(dá),其編碼的蛋白序列中存在3個與酵母金屬硫蛋白表達(dá)激活因子ACE2保守的C2H2結(jié)構(gòu)域,推測該基因可能參與哈茨木霉菌的銅脅迫應(yīng)答及代謝過程。為進(jìn)一步研究其功能,本研究采用基因敲除和過表達(dá)技術(shù),結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序分析,探究了thmea1基因的功能,結(jié)果如下:1、參照哈茨木霉Th33基因組信息,設(shè)計(jì)特異性引物,以Th33菌株cDNA為模板,PCR擴(kuò)增獲得thmea1基因編碼區(qū)序列。測序結(jié)果顯示,該基因全長1446 bp,無內(nèi)含子,擁有1個外顯子,編碼蛋白序列與酵母金屬硫蛋白表達(dá)激活因子ACE2及其同源蛋白SWI5存在3個較為保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域,推測thmea1為C2H2型轉(zhuǎn)錄因子基因,序列提交NCBI獲得GenBank登錄號為MF802279。2、采用同源敲除原理構(gòu)建獲得thmea1基因敲除載體pKH-KO-△thmea1,采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,將敲除載體轉(zhuǎn)入哈茨木霉Th33原生質(zhì)體,篩選獲得thmea1基因敲除突變株△thmea1。以構(gòu)巢曲霉gpdA和trpC為啟動子和終止子構(gòu)建獲得thmea1基因過表達(dá)載體pKH-KO-Othmea1,采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,將過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入Th33原生質(zhì)體,篩選獲得thmea1基因過表達(dá)突變株Othmea1。3、對野生菌Th33、敲除突變株△thmea1和過表達(dá)突變株Othmea1的銅離子耐受實(shí)驗(yàn)顯示,在0~2.4 mM/L銅離子濃度下,Δthmea1的生長速度顯著快于Th33和Othmea1,氣生菌絲量略多,且銅離子耐受中濃度(MIC_(50))為1.92 mM/L,較Th33(MIC_(50)0 1.70 mM/L)和Othmea1(MIC_(50)0 1.74mM/L)提高了約12.9%。銅離子吸附實(shí)驗(yàn)顯示,野生菌和突變株對銅離子的吸附率無顯著差異。綜上表明thmea1基因的缺失提高了哈茨木霉對銅離子的耐受性。4、銅代謝相關(guān)基因的qRT-PCR分析顯示,銅脅迫下,△thmea1中的金屬硫蛋白基因(Tha_07074)表達(dá)水平顯著高于Th33和Othmea1,表達(dá)量約為Th33的5倍,推測thmea1基因負(fù)調(diào)控金屬硫蛋白基因的表達(dá)。P型-ATP酶基因(Tha_08191)在Th33和Othmea1中的表達(dá)水平顯著高于△thmea1,該轉(zhuǎn)運(yùn)酶能夠協(xié)助細(xì)胞內(nèi)銅離子進(jìn)入高爾基體分泌系統(tǒng),暗示thmea1的缺失可能會影響銅離子的胞外釋放過程。5、對野生菌Th33和敲除突變株Δthmea1進(jìn)行了0.8 mM/L銅離子處理下的轉(zhuǎn)錄組測序,顯示在銅脅迫下,核糖體蛋白合成相關(guān)基因、逆境修復(fù)功能類熱激蛋白相關(guān)基因及泛素蛋白相關(guān)基因在Δthmea1中發(fā)生上調(diào)表達(dá),推測thmea1可能具有調(diào)控功能性蛋白質(zhì)再生循環(huán)的作用,其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476
【圖文】：

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 哈茨木霉 thmea1 的克隆與分析（101）100%(1/) KE ，得到 thmea1 擴(kuò)增效率 62.9%，thga1 擴(kuò)增效率為 63.6%，以上結(jié)果表明兩質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，且兩基因擴(kuò)增效率一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠。圖 2.3 thmea1 與 thga1 擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線Fig 2.3 Dissolution curve of amplified products of thmea1 and thga11 2A B

圖 2.6 thmea1 編碼蛋白結(jié)構(gòu)分類預(yù)測Fig. 2.6 Structure classification prediction of thmea1 coding protein2.4 討論本章從哈茨木霉 Th33 中克隆獲得了 thmea1，并對其進(jìn)行了基因組拷貝數(shù)驗(yàn)證、序列分析、同源蛋白檢索及蛋白質(zhì)功能預(yù)測等。對基因拷貝數(shù)的驗(yàn)證采用了雙標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對定量法，該方法在現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因工程中，被廣泛應(yīng)用于外源基因插入拷貝數(shù)的驗(yàn)證，具有準(zhǔn)確快速的特點(diǎn)，該方法的關(guān)鍵是保證被檢測基因與內(nèi)源單拷貝參考基因具有相對一致的擴(kuò)增效率，從而確保絕對定量的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)中 thmea1 與 thga1 的擴(kuò)增效率分別為 62.9%和 63.6%，具有較好的一致性，故結(jié)果可靠。對 thmea1 編碼蛋白序列檢索顯示，該基因在其他木霉中的同源蛋白功能均未驗(yàn)證，為未知蛋白，與剛毛綠僵菌（M.acridum）C2H2 轉(zhuǎn)錄因子 SWI5 和厚垣普可尼亞菌（P. chlamydosporia）金屬硫蛋白表達(dá)激活因子 VFPPC 具有一定的相似性，通過 STRING 功能蛋白數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步檢索，顯示與酵母的兩個 C2H2 型轉(zhuǎn)錄因子 SWI5 和 ACE2 具有較為保守的 3 個 C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)域，其中 ACE2 為酵母金屬硫蛋白 CUP1 表達(dá)調(diào)控因子，此外，通過 CATH 蛋白結(jié)構(gòu)分類數(shù)據(jù)庫的比對顯示 thmea1 為鋅指蛋白類調(diào)控因子基因，綜上推測 thmea1 可能為哈茨木霉金屬硫蛋白表達(dá)調(diào)控因子，且參與哈茨木霉銅脅迫下的調(diào)控作用，其功能需要后續(xù)研究。

2F AGTGACAAACGGTGAAGTTG下游同源臂擴(kuò)增2R GCATCCAATGTTATGGGCmeaF ATGCCTCACCCAATGACAAAthmea1 序列擴(kuò)增meaR GGCTACACCGTTGAACTCGThygF ATGAAAAAGCCTGAACTCACC潮霉素抗性基因擴(kuò)增hygR TTTCCACTATCGGCGAGTtzF ATATACTGCTCAGCCGCCthmea1 基因探針擴(kuò)增tzR AAACTTGTTGCCGCAGTCG3.2 方法3.2.1 thmea1 敲除載體 pKH-KO-△thmea1 的構(gòu)建采用同源敲除原理，將 thmea1 起始密碼子上游 1000 bp 序列插入到 pKH-KO 質(zhì)粒潮霉素抗性基因（hyg）啟動子上游限制性酶切位點(diǎn) BamHⅠ和 EcoRⅠ之間，將 thmea1 基因終止密碼子下游 1000 bp 序列插入到 hyg 下游限制性酶切位點(diǎn) HindⅢ和 XhoⅠ之間，構(gòu)建獲得具有 thmea1 基因同源打靶臂的基因敲除載體 pKH-KO-△thmea1，構(gòu)建原理見圖 3.1 所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2795993