【摘要】：隨著生活質(zhì)量的提高和消費理念的轉(zhuǎn)變,人們對豬肉的品質(zhì)有了更高的要求,生產(chǎn)過程中,氧化應(yīng)激是產(chǎn)生PSE等劣質(zhì)肉的重要原因。不同豬種個體肌肉組織抗氧化能力差異顯著,地方豬種與引進豬種也擁有不同的抗氧化能力。核因子Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor)作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在調(diào)節(jié)機體內(nèi)氧化水平、抗氧化、維護機體正常生理功能方面具有重要作用,且已成為抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)控因子。為了解不同豬種間骨骼肌抗氧化能力,同時進一步認識Nrf2基因的結(jié)構(gòu)與功能,探究Nrf2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,本試驗進行了如下研究:1.通過對大蒲蓮豬、煙臺黑豬、五蓮黑豬、里岔黑豬、沂蒙黑豬、杜長大三元雜交豬骨骼肌SOD活性、MDA含量和T-AOC的檢測,發(fā)現(xiàn)大蒲蓮豬SOD活性和總抗氧化能力T-AOC除與煙臺黑豬差異不顯著(P0.05)外,與其他豬種差異顯著(P0.05);大蒲蓮豬丙二醛(MDA)含量與五蓮黑豬、煙臺黑豬差異不顯著(P0.05),與其他豬種差異顯著(P0.05)。表明大蒲蓮豬骨骼肌有較強的抗氧化能力,為后續(xù)試驗提供基礎(chǔ)。2.使用RACE技術(shù)克隆獲得了大蒲蓮豬Nrf2基因的完整cDNA序列,使用生物信息學(xué)技術(shù),分析和預(yù)測基因的結(jié)構(gòu)和功能。Nrf2基因cDNA全長2358bp,5'UTR87bp,3'UTR495bp。其中CDS區(qū)為1776bp,編碼591個氨基酸。Nrf2蛋白分子量66.4027kDa,理論等電點:pI=4.66,二級結(jié)構(gòu)大部分為α螺旋,無跨膜區(qū),不是分泌蛋白。核苷酸序列與氨基酸序列均與人同源性最高。3.在mRNA水平上,Nrf2廣泛存在于組織和細胞中,在肌肉、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中均可檢測到,且在腎臟和心臟之間存在明顯的表達差異(P0.05)。在腎臟、肺臟和肌肉中表達較高,在心臟中表達最低。在大蒲蓮豬和長白豬肌肉中Nrf2基因表達量存在顯著差異(P0.05)。這表明腎臟在豬抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用;而肌肉、腎臟和肺臟在大蒲蓮豬抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要功能。4.使用染色體步移技術(shù)從大蒲蓮豬基因組克隆得到Nrf2基因5'側(cè)翼2091bp的片段,Nrf2基因5'側(cè)翼區(qū)經(jīng)預(yù)測含有典型的TATA-box,不含CpG島。通過巢式PCR方法以不同上游引物來獲得不同長度的啟動子系列片段,并將這些片段連接到pGL3-Basic載體中,將重組載體和內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進293T細胞,48小時后收集細胞,檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明-903bp~-710bp區(qū)域內(nèi)可能存在正調(diào)控區(qū)或增強子;分析其中存在多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,研究結(jié)果提示,這些位點可能是參與Nrf2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要序列。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828
【圖文】：

轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的結(jié)構(gòu)(Carey,1998)

圖 2 SYBR GREEN 1 原理Fig. 2 Principle of SYBR GREEN 1移技術(shù)（Genome Walking Technique）移技術(shù)（Genome Walking）是一種建立于 PCR 基礎(chǔ)上的分子生種技術(shù)可以快速獲取與已知序列相鄰的未知序列。染色體步移技據(jù)已知的基因序列連續(xù)步移，獲取人或動物的重要調(diào)控基因序表達調(diào)控，如：克隆啟動子并對其功能進行研究。我們可以輕易到人、小鼠、擬南芥等已知序列的側(cè)翼序列，但在清楚目的基知道一個已知序列區(qū)域旁的 DNA 序列，染色體步移技術(shù)無疑是等，2006）。的 TAIL-PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）技術(shù)（Liu e交錯 PCR，與反向 PCR 法、連接接頭法等傳統(tǒng)的染色體步移技

圖 4 總 RNA 電泳圖 (M:DL2000 DNA Marker)Fig. 4 Electrophoretogram of total RNAACE 和中間片段擴增肉組織的總 RNA 為模板，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，分別進的 PCR 擴增。結(jié)果見圖 5。擴增部分的中間片段約 6約 390bp 的條帶（圖 5B），3'RACE 擴增獲得了約 60段序列與預(yù)期片段大小相符。 2 M2 1 2 M2400bp300bp700bp500bp

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 蔡維霞;張軍;胡大海;;氧化和化學(xué)應(yīng)激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路——Nrf2/ARE[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2009年04期

2 劉博;蘇喬;湯敏謙;袁曉東;安利佳;;應(yīng)用于染色體步移的PCR擴增技術(shù)的研究進展[J];遺傳;2006年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

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本文編號：2795808