【摘要】：家蠶是具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目模式昆蟲。繭絲作為飼養(yǎng)家蠶主要的效益產(chǎn)品,其繭絲性狀是蠶桑行業(yè)產(chǎn)量和質(zhì)量效益的主要決定因素,因此充分了解和研究家蠶繭絲性狀,對(duì)選育繭絲性狀良好的蠶品種、提高蠶繭生產(chǎn)效益有著重要的意義。家蠶五齡幼蟲的絲腺能夠大量合成絲蛋白,但是在不同的家蠶品系中,其絲腺合成絲蛋白的能力不同,從而產(chǎn)絲量存在著明顯的差異。探究家蠶產(chǎn)絲機(jī)制以及不同品系家蠶產(chǎn)絲量的差異,挖掘與絲蛋白合成相關(guān)的功能基因,對(duì)闡釋家蠶產(chǎn)絲的分子機(jī)制以及構(gòu)建家蠶生物反應(yīng)器有著促進(jìn)作用。近年來,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,推動(dòng)了基因組學(xué)以及功能基因組學(xué)的研究。本研究以多絲量品系菁松(JS)和少絲量品系蘭10(L10)為研究樣本,對(duì)兩個(gè)品系的家蠶的絲腺以及產(chǎn)絲量展開研究。根據(jù)這兩個(gè)品系家蠶絲腺的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合家蠶繭絲性狀QTL定位的信息,挖掘影響繭絲產(chǎn)量性狀的功能基因,為研究家蠶繭絲性狀的決定機(jī)制打下基礎(chǔ)。1、以多絲量品系JS和少絲量品系L10為研究樣本,構(gòu)建雜交F_2代群體,并對(duì)該群體的部分繭質(zhì)性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在調(diào)查的1179個(gè)F_2代個(gè)體的繭層量和全繭量性狀分離明顯,并且雌雄繭質(zhì)性狀的分布均呈現(xiàn)正態(tài)曲線,符合數(shù)量性狀連續(xù)變異的基本特征,繭層量和全繭量的極大值和極小值接近于親本值。同時(shí)我們對(duì)該F_2代群體的全繭量、繭層量、蛹重和繭層率這四個(gè)繭質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)除了繭層率與蛹重之間的相關(guān)性較低外,其余的幾個(gè)繭質(zhì)性狀之間的相關(guān)系數(shù)均很高。該F_2代群體的調(diào)查和統(tǒng)計(jì),為家蠶繭質(zhì)性狀相關(guān)基因的定位分析提供了基礎(chǔ)樣本。2、本研究小組前期通過高通量測(cè)序技術(shù)得到JS和L10家蠶品系五齡第三天絲腺的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù),獲得了1411個(gè)差異表達(dá)基因,其中包括一些與蛋白生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,它們?cè)趦善废抵g的轉(zhuǎn)錄水平上存在較大差異。結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中家蠶轉(zhuǎn)錄因子的篩選以及生物信息學(xué)分析,以轉(zhuǎn)錄因子E2F為研究對(duì)象,分析該轉(zhuǎn)錄因子在家蠶JS和L10五齡絲腺中的表達(dá)模式。另外根據(jù)已知背景,在果蠅的細(xì)胞周期信號(hào)通路中E2F與Dp結(jié)合激活Ras85D的表達(dá)。我們分析了家蠶同源基因Ras1在五齡絲腺中的表達(dá)譜,同時(shí)根據(jù)qRT-PCR得到的結(jié)果分析了家蠶轉(zhuǎn)錄因子E2F與家蠶Ras1基因的表達(dá)相關(guān)性。比較了E2F與Ras1基因同絲蛋白基因Fib-H,Fib-L,P25五齡后部絲腺的表達(dá)譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾個(gè)基因的表達(dá)相關(guān)性較高,證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子E2F和Ras1基因同三個(gè)絲蛋白基因的表達(dá)模式非常相似,并且這兩個(gè)基因?qū)O絲產(chǎn)量有影響,同時(shí)推測(cè)這兩個(gè)基因在絲蛋白的合成過程中也有一定的影響。3、酪氨酸激酶基因Abl普遍存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),主要是在細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期中起著重要的調(diào)控作用。在家蠶JS和L10絲腺轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中,Abl基因在JS中的表達(dá)量高于L10兩倍左右。我們通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)Abl guide RNA的質(zhì)粒pBac[IE1-DsRed2-U6-Abl-sgRNA 1+U6-Abl-sgRNA 2]。將構(gòu)建好的質(zhì)粒注射到家蠶的卵中,得到G0代自交產(chǎn)卵獲得G1代,篩選得到單陽性個(gè)體,并與Cas9品系雜交,獲得G2代雙陽性個(gè)體的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。我們比較了轉(zhuǎn)基因的雙熒光個(gè)體與野生型家蠶的全繭量與繭層量,發(fā)現(xiàn)均有明顯的差異,其中Abl基因敲除型的突變體全繭量比野生型的降低了11.54%,繭層量比野生型的低25%。因此我們推測(cè)家蠶Abl基因?qū)O絲量生產(chǎn)有一定的影響。本文基于前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,將獲得的差異表達(dá)基因結(jié)合生物信息學(xué)分析以及相關(guān)文獻(xiàn)知識(shí),比對(duì)篩選到轉(zhuǎn)錄因子E2F、家蠶基因Ras1以及家蠶酪氨酸激酶基因Abl,對(duì)這三個(gè)基因在五齡絲腺中的表達(dá)量進(jìn)行定量分析測(cè)定,分析三者之間在細(xì)胞周期信號(hào)通路中的上下游關(guān)系,推測(cè)Abl基因處于另外兩個(gè)基因的上游。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Abl基因進(jìn)行敲除,根據(jù)表型分析以及基因型分析,可以確定家蠶Abl基因?qū)z蛋白的分泌有一定的影響作用。這一研究為解析家蠶產(chǎn)絲的分子機(jī)制提供了部分依據(jù),同時(shí)對(duì)選育家蠶多絲量品種有著指導(dǎo)作用。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S881.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2795526