【摘要】：多糖和Y-聚谷氨酸(γ-PGA)作為兩種常見的絮凝活性物質(zhì),因其具有生物可降解、無毒、高效以及無二次污染等優(yōu)點,在廢水處理、食品與發(fā)酵工業(yè)、飲用水凈化等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。以實驗室自主篩選獲得的菌株Bacillus licheniformis CGMCC2876為出發(fā)菌株,在不同的培養(yǎng)條件下可以同時分泌多糖和γ-PGA兩種具有絮凝活性的胞外聚合物。本論文選取以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)體系為主要研究對象,旨在探究地衣芽孢桿菌多糖合成代謝途徑中的若干關(guān)鍵基因,進而通過基因工程手段構(gòu)建生物絮凝劑高產(chǎn)重組菌株,以挖掘地衣芽孢桿菌多糖絮凝劑的工業(yè)生產(chǎn)潛力。首先選取地衣芽孢桿菌多糖合成代謝途徑中的一系列基因pgcA、crr、gtaB1、epsA以及epsB,通過PCR技術(shù)進行擴增,與實驗室之前構(gòu)建的表達載體pHY300PLK-PamyL-TTamyL進行連接得到基因過表達重組載體,隨后通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入地衣芽孢桿菌中表達,成功構(gòu)建了六株目的基因過表達重組菌株。對重組菌株所產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)量和活性進行測定,并與原始菌株進行對比,其中重組菌株B.licheniformis-pHY300-epsA和B.licheniformis-pHY300-pgcA-gtaB1所產(chǎn)絮凝劑的粗產(chǎn)量與原始菌株相比有明顯提高,分別提高了 23.70%和20.77%。但單獨過表達葡萄糖磷酸變位酶基因pgcA和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1對于地衣芽孢桿菌生產(chǎn)多糖絮凝劑沒有明顯影響,說明增強糖基轉(zhuǎn)移酶基因epsA和串聯(lián)基因pgcA-gtaB1的表達水平可以促進多糖絮凝劑的合成,而單獨調(diào)控基因pgcA和gtaB1的表達對于多糖合成水平的影響很小。重組菌株B.licheniformis-pHY300-epsB不僅可以使絮凝劑的粗產(chǎn)量提高13.98%,達到8.56 g·L-1,還可以使絮凝活性達到5100.50 U·mL-1,較原始菌株提高 117.92%。B.licheniformis-pHY300-epsB所產(chǎn)的絮凝活性物質(zhì)中多糖含量從53.67%降低至28.95%,而γ-PGA含量從34.13%升高到44.03%。同時多糖和y-PGA代謝途徑中一系列關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了變化。碳代謝調(diào)控蛋白基因ccpA和ccpN的轉(zhuǎn)錄水平有所下降,而氮代謝調(diào)控蛋白基因nrgB、γ-PGA合成酶基因pgsA和pgsB、異檸檬酸脫氫酶基因icd以及1-吡咯啉-5-羧酸鹽脫氫酶基因rocA的轉(zhuǎn)錄水平則發(fā)生了不同程度的提高。因此,epsB在多糖和γ-PGA的合成過程中均發(fā)揮了重要的作用,對epsB進行調(diào)控可以改變菌體內(nèi)的碳代謝流方向,從而影響地衣芽孢桿菌多糖和γ-PGA的合成水平。以2 L發(fā)酵罐對B.licheniformis-pHY300-epsB進行擴大培養(yǎng),所產(chǎn)絮凝劑活性較原始菌株提高了 224%,粗產(chǎn)量提高了 36.62%,表現(xiàn)出一定的工業(yè)生產(chǎn)能力。
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;Q93
【圖文】：

（ａ）邐（ｂ）逡逑圖３．２串聯(lián)基因擴X棧ǎ幔蓿茫矗鄭歟叮峰澹ǎ猓╁澹穜潰矗瓅潁攏叔義希疲椋紓澹常插澹裕瑁邋澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹錚駑澹簦幔睿洌澹礤澹紓澹睿邋澹ǎ幔╁澹穡紓悖�，邋＜傯ａn戾澹ǎ猓╁澹穡紓悖粒紓簦幔攏戾義希常玻補菇康幕蜆澩鎦刈櫓柿ｅ義嫌孟拗菩閱誶忻福耍穡睿旌停櫻穡澹燜蓋星薪夯厥盞哪康幕蚱危穡紓悖省ⅲ紓簦錚蛋隋義希澹潁頡ⅲ澹院灣澹澹鰨靛逡約氨澩鐫靨邋澹穡齲伲常埃埃校蹋耍校媯歟鰨擼冢裕�？ｖ嵡G掊澹ǎ擔(dān)常擔(dān)村澹猓穡裕村辶義轄用附康幕蠔捅澩鐫靨辶雍笞敫惺芴赴⑼坎加誑剮云槳邋義仙�，挑取鸭g鑰寺∽幼佑冢蹋驢剮耘嘌�，培养１２邋ｍw笥茫攏椋錚裕澹耄甯嘰恐叔義狹Ｐ×恐票甘約梁刑崛」澩鎦刈櫓柿�，分兵犛H鰨穡齲伲常埃埃穡紓洹ⅲ穡齲伲常埃埃紓簦錚蛋隋義希常稿義

本文編號：2793108