【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是新疆重要的經(jīng)濟作物,新疆主栽甜瓜品種“皇后”因具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀,而廣受消費者喜愛,但其易感病,使品質(zhì)下降,嚴重時導(dǎo)致大面積減產(chǎn)。因此,提高抗病能力是甜瓜生產(chǎn)中急需解決的一個難題。CRISPR/Cas9是一種后天免疫系統(tǒng),存在于所有的古生菌和大多數(shù)細菌中,已在動植物的基因工程和遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用。由于CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)具有高效、便捷、成本低廉等優(yōu)點而備受關(guān)注。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)定點敲除新疆主栽甜瓜品種“皇后”的病毒病感病基因eIF4E和白粉病感病基因MLO,以期獲得廣譜抗病的甜瓜品種。主要結(jié)果如下:1.對分別接種病毒病和白粉病病菌的甜瓜葉片進行RT-PCR半定量,未接種的植株作為陰性對照,結(jié)果表明,接種病毒病和白粉病植株的eIF4E和MLO基因表達量高于對照,初步推測在侵染初期,病毒病和白粉病的病菌需要eIF4E和MLO基因的協(xié)助來完成在甜瓜中的生長繁殖。2.甜瓜eIF4E基因全長為2807 bp,總共含有5個外顯子和4個內(nèi)含子,靶序列中靶率為0.5906;甜瓜MLO基因全長為4500 bp,總共含有15個外顯子和14個內(nèi)含子,靶序列中靶率為0.7729。3.以雙子葉植物敲除載體pP1C.4為模板進行sgRNA框的擴增,成功構(gòu)建了重組載體pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO。4.探索不同濃度組合的IAA和6-BA對“皇后”外植體的影響,結(jié)果表明,當在MS固體培養(yǎng)基中添加的6-BA濃度為1 mg·L~(-1),IAA的濃度為0.05 mg·L~(-1)時,愈傷組織的生長狀態(tài)良好,因而該濃度的激素組合對不定芽具有較高的誘導(dǎo)率。5.本實驗確定了“皇后”對培養(yǎng)基中潮霉素的選擇壓以及頭孢的最適抑菌濃度。當添加濃度為10mg·L~(-1)的潮霉素時,抑制了外植體的生長,可選擇10mg·L~(-1)作為抗生素的臨界濃度;當頭孢的濃度為500 mg·L~(-1)時,對農(nóng)桿菌的抑制效果最好,并且不會對外植體的生長造成太大影響,可將500mg·L~(-1)作為頭孢的最適抑菌濃度。6.通過凍融法成功將重組載體pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,經(jīng)過為期一年多的遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)潮霉素篩選獲得了11株轉(zhuǎn)化植株,通過檢測抗潮霉素基因初步得到9株陽性轉(zhuǎn)化苗,對轉(zhuǎn)化苗的靶序列進行測序比對,結(jié)果表明,在靶位點附近沒有發(fā)生基因突變。本文為甜瓜的抗病研究提供了新的思路,為進一步研究甜瓜eIF4E和MLO基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S652
【圖文】：

圖 1-1 植物總 RNA 的提取 Marker:2000bpFig 1-1 Extraction of Plant Total RNAMarker: 2000b 基因表達差異分析為模板，合成 cDNA 的第一鏈，然后進行 如下圖，泳道 1 為接種葉的目的基因擴增條條帶，第二行是甜瓜 Actin 的擴增結(jié)果，條。圖 1-2 為 eIF4E 基因擴增結(jié)果，第 1 和第毒的侵染，eIF4E 均有表達，且第 2 泳道條 基因的表達量上升；圖 1-3 為 MLO 基因擴侵染，MLO 基因均有表達，且第 2 泳道條LO 基因的表達量上升。

圖 1-2 eIF4E 基因在葉片中的表達差異1：接種葉；2：陰性對照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control圖 1-3 MLO 基因在葉片中的表達差異1：接種葉；2：陰性對照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control討論2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜馬鈴薯 Y 病毒屬病毒的致病因子。隨后在國外也陸續(xù)出現(xiàn)了大量有關(guān)于4E 基因的研究，國內(nèi)研究比較多的植物有番茄、煙草、番木瓜等等，而對于的 eIF4E 基因未見報道。2009 年陳鴻[58]從甜瓜中克隆了 MLO 家族的三個基因，分別為 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和擬南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有較近的進化關(guān)系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在葉片中的表達高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐堅[65]對甜瓜 MLO 基

圖 1-2 eIF4E 基因在葉片中的表達差異1：接種葉；2：陰性對照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control圖 1-3 MLO 基因在葉片中的表達差異1：接種葉；2：陰性對照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control討論2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜馬鈴薯 Y 病毒屬病毒的致病因子。隨后在國外也陸續(xù)出現(xiàn)了大量有關(guān)于4E 基因的研究，國內(nèi)研究比較多的植物有番茄、煙草、番木瓜等等，而對于的 eIF4E 基因未見報道。2009 年陳鴻[58]從甜瓜中克隆了 MLO 家族的三個基因，分別為 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和擬南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有較近的進化關(guān)系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在葉片中的表達高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐堅[65]對甜瓜 MLO 基

【參考文獻】

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本文編號：2792691